课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段教学设计内容推荐

教学准备 1.

教学目标 1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

2.

教学重点/难点 教学重点：PCR的原理和PCR的基本操作

教学难点：PCR的原理

3.

教学用具 教学课件

4.

标签 教学过程 （一）引入新课

回忆DNA分子的结构

1、组成元素：C、H、O、N、P 2、基本单位: 脱氧核苷酸

3、脱氧核苷酸结构

（二）、细胞内的DNA复制

1、概念：由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程

2、时期：有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期

3、场所：细胞核（主）、线粒体、叶绿体

4、模板：DNA母链

5、原材料：脱氧核苷酸

6、基本条件:酶、ATP、原料、模板

7、复制过程: ① DNA的解旋 ② RNA引物的合成

③ DNA的生成 ④切掉引物生成冈崎片断 ⑤ DNA片断的连接

8、复制特点: 边解旋边复制(过程）、半保留复制（结果）

9、遵循原则：碱基互补配对原则

10、精确复制的原因：

①规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板

②碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行

（三）、聚合酶链式反应

PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。

1．PCR原理

PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：

1．1细胞内DNA复制条件分析：

1．2细胞内DNA复制过程

（1）DNA的反向平行结构：（结合教材图5－6）

核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）

由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。

DNA双螺旋结构的反向平行结构：

（2）DNA的复制过程: 解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

DNA聚合酶结合：

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）

子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。

［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？

DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。

［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。

1．3 DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。

反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。

［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）

2．PCR的反应过程

变性：在95℃时DNA解旋

复性：在50℃时引物与DNA单链结合

延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）

3．实验操作

3．1 PCR反应体系：

缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水

3．2 实验操作步骤

3．3 按照PCR反应体系配方配制反应液；

（1）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；

（2）将微量离心管放到PCR仪中；

（3）设置PCR仪的工作参数。

（4）DNA在PCR仪中大量扩增。

3．4 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。

4．实验注意事项

（1）避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

（2）缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

（3）每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

（4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

5．结果分析与评价

（1）反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。

（2）将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

（3）计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数

（四）、PCR产物鉴定：

琼脂糖凝胶电泳技术

1、实验原理

在外加电场的作用下，带电粒子发生迁移的现象叫电泳。在电场中，带电分子向着与其所带电荷相反的电极移动。

在施以一定强度的电场中，带负电荷的DNA在琼脂糖凝胶中可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片段的长度成负相关，与电压强度成正比，利用这一性质可以分离不同长琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物：

（1）制胶 （2）点样 （3）电泳

（4）紫外投射分析仪观察并照相

2、两种染料：

6×上样buffer：维持反应体系的pH不变，而且上样buffer常以溴酚蓝为指示剂，稀释成1×后比重仍然较大，上样时极易下沉，且颜色清晰可见。

DNA荧光染料：由于DNA不能直接观察到，所以利用一种核酸的荧光染料与PCR的产物DNA结合后再电泳，电泳结束后，可用紫外透射分析仪观察电泳结果。

3、可以用已知长度的DNA

“Marker”作为参照，对电泳图谱进行比对，估算未知DNA分子的长度，同时根据带的宽度，估算未知DNA分子的数目。

（五）、PCR的应用

PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在分子生物学、医学和案件侦破等领域得到广泛应用。

课堂小结 PCR的技术，需要首先了解细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件。掌握PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化。这部分内容的应以读图识图为主。在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。今天我们来学习研究了DNA分子的扩增技术――PCR技术。希望大家能够掌握和理解。

板书 专题五 第2节 多聚酶链式反应扩增DNA片段

一、细胞内的DNA复制

二、聚合酶链式反应

1、PCR扩增的原理

2、PCR扩增的过程

三、PCR产物鉴定

琼脂糖凝胶电泳技术

四、PCR的应用