课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课堂实录

第2课时

土壤中分解尿素的

细菌的分离与计数

1.简述尿素在生产实践中的作用及分解尿素的细菌的作用。

2.研究培养基对微生物的选择作用。

3.进行土壤中分解尿素细菌的分离与计数。

4.简述活菌计数技术的应用。

一、理论基础

1.筛选菌株

(1)实验室中微生物筛选的原理:人为提供有利于①

目的菌株

生长的条件(包括营养、温度、pH等),同时②

抑制

或③

阻止

其他微生物生长。

(2)选择培养基:在微生物学中,将允许④

特定

种类的微生物生长,同时⑤

抑制

或⑥

阻止

其他种类微生物生长的培养基,称作选择培养基。 2.统计菌落数目:常用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。当样品的⑦

稀释度

足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个⑧

活菌

。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确,一般选择菌落数在⑨

30~300 的平板进行计数。此外,测定微生物数量的常用方法还有⑩

显微镜

直接计数。 3.设置对照:设置对照的主要目的是排除实验组中

非测试因素

对实验结果的影响,提高实验结果的

可信度

。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了,需有

空白对照

。 二、实验设计

土壤中某样品细菌的分离与计数实验的操作步骤

1.

土壤

取样:从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3

cm左右,再取样。 2.制备

培养基

:准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基,将菌液稀释相同的倍数,在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目,因此,牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照,用来判断选择培养基是否起到了选择作用。 3.微生物的

培养

与观察:将10

g土样加入盛有90

mL无菌生理盐水的锥形瓶中(体积为250

mL),充分摇匀,吸取上清液

1

mL ,转移至盛有

9

mL 的生理盐水的无菌大773试管中,依次等比稀释至10稀释度,并按照由10~10稀释度的顺序分别吸取

0.1

mL 进行平板涂布操作。每个稀释度下需要3个选择培养基、1个牛肉膏蛋白胨培养基。

将涂布好的培养皿放在30

℃温度下培养,及时观察和记录。

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含

选择

培养基的斜面中,观察能否产生颜色反应。 4.细菌的计数:当菌落数目稳定时,选取菌落数在

30~300 的平板进行计数。在同一稀释度下,至少对3个平板进行重复计数,然后求出

平均数

,并根据平板所对应的稀释

度计算出样品中细菌的数目。

1.如何确认所制备的选择培养基的确起到了选择作用?

2.分离分解尿素的细菌的培养基为何能起到选择作用?

3.如何对活菌进行计数?

知识点一:

筛选菌株

1.筛选菌株的原理是什么?请举例说明。

2.简述筛选菌株的方法。

3.请简述选择培养基的制备原理、制备方法、用途及实例。

知识点二:统计菌落数目和设置对照

1.如何对样品中微生物进行计数?试简述相关方法的原理及缺点。

2.如何计算每克样品中的菌落数?

3.设置对照实验的目的是什么?请举例说明。

64.在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时,A同学从对应的10倍稀释的培养基中筛选出大约230个菌落,但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约100个菌落。试分析其原因并设计探究方案,根据结果得出结论。

例1 下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是(

)。

A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水

B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、水

C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、水

D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水

例2 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数,在对应稀释倍数为10的培养基中,得到以下几种统计结果,正确的是(

)。

A.涂布了一个平板,统计的菌落数是230

B.涂布了两个平板,统计的菌落数是215和260,取平均值238

C.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是21、212和256,取平均值163

D.涂布了三个平板,统计的菌落数分别是210、240和250,取平均值233

6

1.本课题以土壤中的细菌为研究对象,要达到的目的是(

)。

①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

②从土壤中分离出能够分解氨的细菌

③统计每克土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌

④统计所取土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌

A.①③

B.②④

C.①②

D.③④

2.下列说法错误的是(

)。

．．A.因为土壤中各类微生物的数量不同,所以为获得不同类型的微生物,要按不同的稀释倍数进行分离

B.测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量,选用的稀释范围不同

C.只有得到了3个或3个以上菌落数目在30~300的平板,才说明稀释操作比较成功,并能够进行菌落的计数

D.牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目,说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落

3.下列说法不正确的是(

)。

．．．A.科学家从70~80

℃热泉中分离到耐高温的Taq

DNA聚合酶

B.若统计到某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5,可以M3作为该样品菌落数的估计值

C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度

D.同其他生物环境相比,土壤中的微生物数量最大,种类最多

4.尿素是一种重要的农业肥料,但若不经过细菌分解,就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多,同学们试图探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用,设计了以下实验,并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌),培养基成分如表所示,实验步骤

如图所示。请分析回答问题。

琼脂

尿素

葡萄糖

MgSO4·7H2O

Na2HPO4

KH2PO4

15

g

1

g

10

g

0.2

g

2.1

g

1.4

g

将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000

mL

(1)培养基中加入尿素的目的是筛选

,这种培养基属于

培养基。 (2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的

和

,实验需要振荡培养,原因是

。 (3)转为固体培养基时,常采用

的方法接种,获得单菌落后继续筛选。 (4)下列材料或用具:①培养细菌用的培养基与培养皿;②玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管;③实验操作者的双手。其中需要灭菌的是

;需要消毒的是

。(填序号)

(5)在进行分离分解尿素的细菌的实验时,A同学从培养基上筛选出大约150个菌落,而其他同学只筛选出大约50个菌落。A同学的实验结果产生的原因可能有

。(填序号)

①由于土样不同

②由于培养基被污染

③由于操作失误

④没有设置对照

参考答案

第2课时

土壤中分解尿素的

细菌的分离与计数

知识体系梳理

①目的菌株

②抑制

③阻止

④特定

⑤抑制

⑥阻止

⑦稀释度

⑧活菌

⑨30~300

⑩显微镜

1

mL 非测试因素

9

mL 0.1

mL 可信度

选择

空白对照

30~300 土壤

培养基

培养

平均数

基础学习交流

1.欲确认所制备的选择培养基是否起到了选择作用,应同时对对照组的牛肉膏蛋白胨培养基进行接种——若对照组培养基中菌落种类明显复杂于实验组,则可确认选择培养基的确起到了选择作用。

2.微生物的生长需要氮源,大多数微生物不能直接利用尿素作氮源,但分解尿素的细菌却可以尿素作氮源,因此,在以尿素为唯一氮源的培养基中,唯有能利用尿素的微生物方可生长繁殖,其他微生物则因不能生长繁殖而被淘汰,因而该培养基可起到筛选分解尿素的细菌的作用。

3.菌落是单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度,形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞的群落。可以通过稀释涂布平板法计算活菌的数目,其原理是培养基上的一个菌落来源于一个活菌。

重点难点探究

知识点一:

筛选菌株

1.人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等),造成有利于该菌生长的环境,同时抑制或阻止其他微生物生长。培养一定时间后,该菌数量上升,再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。实例:从热泉中筛选出Taq细菌。热泉70~80

℃的高温条件淘汰了绝大多数微生物,从而使耐热的Taq细菌脱颖而出。

2.利用选择培养基分离某种菌株。选择培养基指允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

3.(1)制备原理:根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学因素、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(2)制备方法:在培养基中加入某种允许特定种类微生物生长、抑制或阻止其他种类微生物生长的化学成分。

(3)用途:使混合菌株中的劣势菌变成优势菌,提高该菌的筛选率。

(4)实例:氮源只加入尿素可得到利用尿素的微生物;加入青霉素可分离得到酵母菌和霉菌。

知识点二:统计菌落数目和设置对照

1.①显微镜直接计数法原理:利用血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积内样品中微生物的数量。缺点:不能区分死菌与活菌;不适于对运动细菌的计数;需要相对高的细菌浓度;

个体小的细菌在显微镜下难以观察。

②间接计数法(活菌计数法)

原理:在稀释度足够高时,微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的,即一个菌落代表原先的一个单细胞,从而推算样品中微生物的数量。

缺点:统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

2.每克样品中的菌落数=(C÷V)×M,其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。

3.目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度。例如,为了排除培养基是否被杂菌污染了,需有空白对照。

4.原因:(1)土样不同;(2)培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)。

方案一:其他同学用与A同学相同土样进行实验。

结果预测:如果结果与A同学一致,则证明A无误;如果结果不同,则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二:将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养,作为空白对照,以证明培养基是否受到污染。

思维拓展应用

例1 A

【解析】能合成脲酶的细菌才能分解尿素,选择的原则是只有能够利用尿素的微生物才能够生长。该选择培养基应只含尿素一种氮源,并能让该类细菌生长,须有碳源。

例2 D

【解析】在设计实验时,一定要涂布至少3个平板,作为重复组,才能增强实验的说服力与准确性,所以A、B不正确。C项虽涂布了3个平板,但是,其中一个平板的计数结果与另两个相差太远,说明在操作过程中可能出现了错误,因此,不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。

基础智能检测

1.A 2.C 3.B

全新视角拓展

4.(1)目的菌

选择

(2)尿素

葡萄糖

为目的菌提供氧气

(3)稀释涂布平板(平板划线) (4)①和②

③

(5)①②③

【解析】(1)培养基中加入尿素的目的是筛选可分解尿素的细菌。(2)尿素可为分解尿素的细菌提供氮源,振荡可为目的菌株提供氧气。(3)在固体培养基中接种常用稀释涂布平板法和平板划线法。(4)操作器械需灭菌,操作者双手需消毒。(5)土样不同、培养基被污染、操作失误均可能导致计数误差。