课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教案3

《课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》教学设计 教学目标

知识与技能

1、利用选择培养基分离细菌

2、运用相关技术解决生产生活中有关微生物计数的问题

过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性

情感态度和价值观

形成无菌不在的观念，养成讲究卫生的习惯

教学重点

对土样的选取和选择培养基的配制

教学难点

对分解尿素的细菌的计数

教学过程

引入新课

上节课我们学习了培养基的配制以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。

进行新课

一、课题背景

引导学生阅读，提出问题。学生自主学习，回答问题。

（一）、尿素的利用：尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。

（二）、细菌分解尿素的原因：只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用

脲酶

CO(NH2)2 + H2O

CO2 +2NH3

（三）、尿素的人工合成：尿素是人工合成的第一个有机物

尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为

氨和CO2

，这是因为细菌能合成

脲酶

。

（四）、课题目标：

1、分离：从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

2、计数：统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌

二、研究思路

（一）、筛选菌株：

1、实例：提出的问题：

如何寻找耐高温的酶？

解决问题的思路：寻找耐高温生物，寻找耐高温环境；

启示：在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

原理：高温淘汰其他菌，选出耐高温细菌，耐高温菌种提取耐高温酶。

2、实验室中微生物筛选的原理：

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长

。

3、方法——选择培养基：

（1）、概念：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

（2）、设计思路：

①根据某些微生物特殊营养需求

Ⅰ、缺乏某种营养物质：如：缺乏氮源的选择培养基分离固氮微生物

缺乏碳源的选择培养基分离自养微生物

Ⅱ、某种营养成分为特定化学成分：

如：石油为唯一碳源的选择培养基分离消除石油污染的微生物

纤维素或石蜡油为唯一碳源的选择培养基分离能分解纤维素或石蜡油的微生物

②在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物。

如：在培养基中加入青霉素、四环素或链霉素（可以抑制细菌或放线菌的生长）分离酵母菌和霉菌等真菌

在培养基中加入高浓度的食盐：分离金黄色葡萄球菌

在培养基中加入抗生素：分离含有目的基因的受体细胞

在培养基中加入氨基嘌呤：分离杂交瘤细胞

改变微生物的培养条件;将培养基在高温环境中培养：分离耐高温的微生物

（3）、培养基选择分解尿素的微生物

本课题使用的培养基配方

的原理：

KH2PO4

1.4g 该培养基的配方中，为微生物的生长提NaHPO4

2.1g MgSO4 H2O

0.2g 供碳源和氮源的分别是什么物质？

葡萄糖

10.0g 碳源：葡萄糖、尿素；氮源：尿素

在该培养基配方中，为微生物的生长提尿素

1.0g 供碳源的是

葡萄糖

，提供氮源的的是

琼脂

15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。

尿素

，琼脂的作用是

凝固剂

。

此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？

能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。

总结：本培养基尿素为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。

点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。

思考：在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是

葡萄糖

，提供氮源的的是

尿素

，琼脂的作用是

凝固剂

。

思考：该培养基对微生物

具有

（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是

只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长

。

（二）统计菌落数目：

1、间接计数法——稀释涂布平板法：

（1）、原理：1个菌落→1个活菌

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌。

利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是

恰当的稀释度

。

（2）、过程：稀释涂布平板→统计菌落数

（3）、统计原则：

①遵循平行重复原则，设置重复组：每个稀释度取3个平板取其平均值

②计数的时机：当各平板上菌落的数目稳定时进行计数。

③选择可用于计数的平板：选

30∼300 个菌落的平板统计

（4）、公式：每克样品中的菌株数=（C/V)* M

C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:所用稀释液的体积；M:稀释倍数。

（5）、注意事项：

统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因：这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是

一个

菌落。因此，统计结果一般用

菌落数

来表示。

例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。

2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？

甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）

乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值

说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。

第

二

位同学的结果接近真实值。你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。

2、显微镜直接计数

（1）、血细胞计数板：

（2）、将待测样品与等量的已知含量的红细胞液混匀后，涂布在载玻片上，经固定染色后，在显微镜下随机选若干个视野进行计数，得出细菌与红细胞的比例，再根据红细胞的含量计算出单位体积内的细菌数目。

公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量

3、滤膜法：

（1）、适用范围：适用于杂质较少的水样，如测定饮用水中大肠杆菌的数目

。

（2）、原理：通过检测培养基中的大肠杆菌菌落数目，计算出水样中大肠杆菌的数目。

（3）、方法：将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养液基上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。

（三）设置对照

1、设置对照的目的：

排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

对照实验是指除了

被测试

的条件外，其他条件都

相同

的实验。满足该条件的称为

对照组，未满足该条件的称为实验

组。

2、方法：

（1）、空白对照：空白对照指不做任何实验实验的对照组或不给对照组以任何处理因素

（2）、条件对照

给对照组施以某种处理因素，但

处理因素不是研究因素。

（3）、自身对照：指对照组和实验组都在同一研究对象上进行。

（4）、相互对照是指不单独设对照组，而是几个实验组相互对比对照

3、实例：

利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为106的培养基中，A、B两同学分别得到以下两种统计结果。

1、A同学筛选出150个菌落。

2、B同学筛选出50个菌落。

B认为A的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基中生长。A确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。

请你帮助A同学改进实验，提供具有说明了的证据。

方案一：由其他同学用与A同学相同土样培养基进行实验 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

方案三：重新配制尿素为唯一氮源的培养基，进行土样的培养，证明是否混入了其它的含氮物质。

小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

三、实验设计

（一）、实验流程：P23图2-7 （二）、实验步骤：

1、土壤取样

（1）、过程：从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的

信封中。

（2）、土壤取样：

①、取样的位置：

土壤，天然培养基，含有大量的微生物，其中70∼90％是细菌。在富含有机质的土壤层的3∼8cm处中分布着绝大多数的细菌。

②、取样要求：铲去表层土。原因：

2、样品的稀释

（1）、过程：

测细菌数：一般用104、105、106稀释液

（2）测放线菌：一般用103、104、105稀释液

（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液

原则：确保平板上的菌落数在30∼300之间。

（三）微生物的培养与观察

1、接种：用适当的稀释液作涂布平板

2、培养：细菌：30∼37℃，1∼2d;

放线菌:25∼28℃, 5∼7d;

霉菌: 25∼28℃, 3∼4d. 3、观察：

a.每24h统计一次菌落数目

b.以“稳定菌落”为观察对象，菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

思考：土壤微生物种类最多、数量最大的原因是什么？

土壤中营养物质含量丰富，环境条件适宜等。

思考：在研究未知微生物时务必规范操作，以防被致病微生物感染，实验后一定要洗手。

四、操作提示：

五、结果分析与评价

1、对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助

生物化学

的方法。

2、在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的

脲酶

将尿素分解成了

氨

。氨会使培养基的碱性

增强

，PH 升高

。因此，我们可以通过检测培养基

pH 变化来判断该化学反应是否发生。

3、在以

尿素

为唯一氮源的培养基中加入

酚红

指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变

红

，说明该细菌能够

分解尿素

。

思考：测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到

伊红美蓝

培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现

黑

色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取

三

个水样。

六、鉴定：

（一）、原因：

（二）、鉴别培养基：不影响微生物的生存

酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。

原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→

酚红变红→脲酶阳性

板书设计

人为

有利于目的菌株生长

土壤

分离筛选微生物的原理

条件

抑制或阻止其他微生物生长

中尿

素分稀释涂布平板法

解菌微生物计数方法与原理

显微镜直接计数

的分

对照设置与重复设置

离与

计数

实验方案

实验操作

结果与分析

实验设计

教学反思

本节课可以从尿素在农业上的重要应用切入，介绍能分解尿素的细菌，进而说明这种细菌的作用是能够合成分解尿素的酶。在教学过程中，可以联系生产生活实际，使学生对尿素以及分解尿素的细菌形成一定的感性认识。同时通过课题背景的介绍，可以进行STS教育。对于实验中的对照原则，可以指导学生分组讨论，在掌握微生物分离技术的同时巩固实验设计的基本原则。