课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数公开课教学设计模版

2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 教案 （人教版选修1）

●课标要求

研究培养基对微生物的选择作用。用土壤浸出液进行细菌培养，仅以尿素为氮源，测定能生长的细菌的数量。

●课标解读

1．研究培养基对微生物的选择作用。

2．进行微生物的数量测的定。

●教学地位

本课题主要介绍了选择培养基的相关知识及利用稀释涂布平板法对微生物进行计数，选择培养在微生物实验室培养中是经常使用的一种方法，它能够从众多微生物中选择出符合要求的目的菌株。活菌计数法是一种常用的微生物的计数方法，通过本课题可学会这种方法，并理解其原理。

●教法指导

1．选择培养基的选择原理，教材给出了研究思路，可让学生自主阅读该部分，学生不难得出相应的结论，明确选择培养基的选择原理之后，教师可举例说出“人为控制有利于目的菌株的生长条件”中的“条件”所包含的内容，然后引导学生思考：如果要分离土壤中能分解尿素的微生物，应该控制何种条件？接着再根据教材中给出的本课题所使用的培养基的配方，让学生找出其中的碳源、氮源等成分，分析哪种成分在其中起到了选择作用。

2．统计菌落数目的教学，教师可通过从简到难的方式在帮助学生理解原理，即若涂布的培养液(0.1mL)中有1个细菌，则培养基上得到一个菌落，那么1mL培养液中有10个细菌，若涂布的培养液(0.1mL)中有10个细菌，则培养基上得到十个菌落，那么1mL培养液中有100个细菌，设问：如果培养基上得到了55个菌落，那么1mL培养液中有多少细菌呢？接着再结合不同的稀释倍数进行引导，重点是让学生理解教材中的计算公式，而不是简单的记忆。

3．对于计数过程中注意事项的教学，教师可展示一个培养皿，让学生思考，假设这个培养皿中的培养基上有1000个菌落，或者只有1个菌落，这样计算来的结果是否准确？然后让学生带着问题阅读教材相关内容，使学生明确对于稀释倍数的选择，及设置对照的相关问题。

●新课导入建议

可利用课题背景进行导入，农业生产上尿素是一种重要的氮肥，但农作物却不能吸收，根据教材中给的尿素在脲酶的作用下分解的反应式，理解尿素作为氮肥的原因。由此引出分解尿素的微生物在尿素转化成氨的过程中起着非常重要的作用，如何获得这些微生物？某农田的一克土样中含有多少这样的微生物？通过问题引入本课题的学习。

●教学流程设计

学生课前预习：阅读教材P21－26，填写【课前自主导学】，完成“思考交流1、2、3”。了解本课题的基础知识。步骤1：情景导课：以【新课导入建议】引出本节课题。通过学生阅读、提问进行基础知识部分的教学。步骤2：通过【课堂互动探究】探究1，并联系课题1，明确培养基可按照不同的分类标准分成多种，并熟悉各种不同培养基的功能。通过例1巩固。步骤3：对于实验设计部分，先让学生再次阅读有关资料和操作提示，明确几个重要步骤中的注意事项。

步骤6：回顾基础知识，将检查、批阅【课前自主导学】时学生出错较多的步骤5：重点强调计数的方法，如为什么选择菌落数目在30～300之间的平板进行计数？如何设置重复组？如何设置对照组？这种计数计算的结果比实际结果如何，为什么？并通过例2巩固、提升。步骤4：教师利用【课堂互动探究】探究2将整个实验流程给出，并结合学生的阅读情况，强调几个重要步骤中的注意事项。

步骤7：引导学生通过合作，整理本课题的重点、难点内容，利用【本课知步骤8：通过【当堂双基达标】进行当堂检测验收。

课

标

解

读

1.研究培养基对微生物的选择作用。

2.进行微生物数量的测定。

2.对分解尿素的细菌的计数。(难点) 重

点

难

点

1.对土样的选取和选择培养基的配制。(重点)

筛选菌株的思路

1.原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

2．选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。

1．根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？

【提示】

可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。

微生物的计数方法

1.常用方法：测定微生物数量的常用方法有活菌计数法和显微镜直接计数法。

2．活菌计数法的原理及计算

(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含有的活菌数。

(2)计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。

M：代表稀释倍数。

(3)注意事项

①为了保证结果准确，一般设置3个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。

②统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数，而不是用活菌数来表示。

③设置对照：设置对照的主要目的是排除实验中非测试因素对实验结果的影

响，提高实验结果的可信度。例如，为了排除培养基是否被杂菌污染了，需要用培养该种微生物的无菌培养基作为空白对照。

2．为何统计的菌落数往往比实际活菌数低？

【提示】

因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的长成的菌落是一个。

1.土壤取样

(1)土壤取样的原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多。

(2)土壤要求：富含有机质，pH接近中性且潮湿。

(3)取样部位：距地表约3～8_cm的土壤层。

2．样品稀释

(1)稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。

(2)稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300_之间，便于计数。

(3)稀释倍数

①测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养。

②测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释。

③测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释。

3．微生物的培养与观察

(1)培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

(2)观察：每隔24 h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

4．细菌的计数

当菌落数目稳定时，取同一稀释度下的3个平板进行计数，选取菌落数相近的平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

实验设计

3．土壤有“微生物的天然培养基”之称，为什么？

【提示】

由于土壤具备了各种微生物生长所需的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，是微生物生活的良好环境。对微生物来说，是微生物的“大本营”；对人类来说，是最丰富的“菌种资源库”。

1.无菌操作

(1)取土样的用具在使用前都需要灭菌。

(2)应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

(3)在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

2．菌种鉴定

细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

1．取土样的小铁铲和盛土样的信封在使用前不需灭菌。(×) 【提示】

都需要灭菌。

2．测定放线菌的数量一般选用104、105和106倍的稀释液。(×) 【提示】

应是103、104、105倍的稀释液。

3．分离不同的微生物要采用不同的稀释度。(√) 【提示】

土壤中各类微生物的数量不同，因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

4．活菌计数法计算出的结果比实际结果偏大。(×) 【提示】

比实际值低。

操作提示

【问题导思】

①培养基有哪些类型？

②选择培养基中特殊成分或因素的作用是什么？

1．培养基的分类

标准

物理性质

固体培养基

半固体培养基

液体培养基

化学组成

合成培养基

培养基类型

加入琼脂较多

加入琼脂较少

不加琼脂

由已知成分配制而成，培养基成分明确

由天然成分配制而成，培养基成分不明确

添加某种指示剂或化学药剂

添加(或缺少)某种化学成分

配制特点

菌种分离、鉴定、计数

菌种保存

工业生产，连续培养

菌种分类、鉴定

主要应用

培养基的类型与选择培养基

天然培养基

目的用途

鉴别培养基

工业生产，降低成本

菌种的鉴别

选择培养基

2.选择培养基

菌种的分离

(1)选择培养基的制备原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(2)选择培养基的制备方法：在培养基中加入某种允许特定种类微生物生长，抑制或阻止其他种类微生物生长的化学成分。

(3)选择培养基的用途：使混合菌株中的劣势菌变成优势菌，提高该菌的筛

选率。

(4)实例：加入尿素可得到利用尿素的微生物；加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌。

生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等均可以选择出目的微生物，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。

(2013·青岛高二检测)甲、乙、丙是三种微生物，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖，甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是(

)

成分

粉状硫10 g KH2PO44 g FeSO40.5 g 蔗糖10 g (NH4)2SO40.4 g H2O100 mL MgSO49.25 g CaCl20.5 g A.甲、乙、丙都是异养微生物

B．甲、乙都是自养微生物，丙是异养微生物

C．甲是异养微生物，乙是固氮微生物，丙是自养微生物

D．甲是固氮微生物，乙是自养微生物，丙是异养微生物

Ⅰ

＋

＋

＋

＋

－

＋

＋

＋

Ⅱ

＋

＋

＋

－

＋

＋

＋

＋

Ⅲ

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

＋

分析找出找出确定培养【思维导图】

→碳源、→特殊→培养

基成氮源条件物类型分【精讲精析】

利用不同的选择培养基可分离出我们所需的微生物。从表格中可看出，Ⅰ培养基中无氮源，Ⅱ中无碳源，Ⅲ为完全培养基。由此可知能在Ⅰ中生存的甲只能是固氮微生物，能在Ⅱ中生存的乙是自养微生物，丙只在Ⅲ中存活，为异养微生物。

【答案】

D

【问题导思】

①从土壤中分离分解尿素的细菌的分离与计数实验如何设计？

②设计实验时应注意哪些问题？

1．实验步骤

土壤取样(从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土，迅速取土壤并装入无菌信封密封)

制备培养基(准备选择培养基)

样品的稀释(在火焰旁称取土壤10 g，放入90 mL无菌水的三角烧瓶中，振摇使土样与水充分混合，将菌分散，制成101倍土壤稀释液；用一支1 mL无菌吸管从中吸取1 mL土壤悬液注入盛有9 mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀，制成102倍土壤稀释液；以此类推制成103、104、105、106倍土壤稀释液)

取样涂布(在上述选择培养基的9个平板底面，每三个一组分别用记号笔写上104、105、106倍的三种稀释液，然后用三支1 mL无菌吸管分别由104、105、106倍的三支试管土壤稀释液中吸取0.1 mL对号放入已写好稀释度的平板中，用实验设计

无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀)

培养观察(将培养基平板倒置于30～37 ℃恒温箱中培养1～2天，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。算出同一稀释度的三个平板上的菌落平均数) 2．注意事项

(1)如图，在三个不同的稀释倍数下分别涂布多个平板，若某一稀释下的所有平板的菌落数目均在30～300之间，则选择该稀释倍数进行记数。

样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图

(2)某一稀释倍数下，多个平板中有个别平板上的菌落数目与其他平板差异较大则应该舍去，或重新实验。

(3)计算结果为每克土样中的菌株数，若样品为液体，则计算结果为每毫升样品中的菌株数。

3．实验设计原则

(1)设立重复组：

统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布三个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。

(2)设立两种对照组：

①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的选择培养基同时进行培养。

②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。

4．结果分析

内容

有无杂菌污

染的判断

对照的培养皿中无菌落生长

培养物中菌落数偏高

菌落形态多样，菌落数偏高

选择培养基的筛选作用

样品的稀释操作

现象

结论

未被杂菌污染

被杂菌污染

培养物中混入其他氮源

牛肉膏培养基上的菌落数大于选择培养基上的菌落数目

得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板

若选择同一种土样，统计结果应接近

选择培养基具有筛选作用

操作成功

重复组的结果

1．在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组。

2．在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，如果差别过大，则意味着操作有误，需要重新实验。

自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。

(1)步骤如下：

①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

②若对大肠杆菌进行计数，应选用________________法接种样品。

③适宜温度下培养。

(2)结果分析

①测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是________。

A．一个平板，统计的菌落数是23 B．两个平板，统计的菌落数是22和26，取平均值24 C．三个平板，统计的菌落数分别是31、9和32，取平均值24 D．四个平板，统计的菌落数分别是31、32、34和35，取平均值33 ②一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)________。

③用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________(填“多”或“少”)，因为________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

【审题导析】活菌计数法应采用规定的接种方法，统计菌落数目时需分析重复组的结果，符合要求才能用来计数。根据活菌记数法的计式及计算原理计算每毫升样品中的菌株数，并进行结果分析。

【精讲精析】

(1)②若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂布平板法接种样品。(2)①应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。②23.4÷0.2×106＝1.17×108。③因为菌落可能由1个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。

【答案】

(1)②稀释涂布平板

(2)①D

②1.17×108

③多

当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的是一个菌落

本

课

知

识

小

结

网

络

构

建

结

论

语

句

1．选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

2．设置对照的主要目的是排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

3．不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

4．在标记培养皿时，应注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。

5．为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板上进行计数。

1．(2013·烟台高二测试)本课题以土壤中的细菌为研究对象，要达到的目的是(

) ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

②从土壤中分离出能够分解氨的细菌

③统计每克土壤样品中含有多少分解尿素的细菌

④统计所取土壤样品中含有多少分解尿素的细菌

A．①③

C．①②

B．②④

D．③④

【解析】

该实验是为了分离出能分解尿素的细菌，根据活菌计数法，计算出的是每克土壤样品中的菌株数。

【答案】

A 2．关于土壤取样的叙述，错误的是(

) A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤

B．先铲去表层土3～8 cm左右，再取样

C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌

D．应在火焰旁称取土壤

【解析】

土壤取样过程中，为防止杂菌污染，取样用的小铁铲和信封在使用前必须灭菌。

【答案】

C 3．用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是(

) A．未接种的选择培养基

B．未接种的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基

C．接种的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基

D．接种的选择培养基

【解析】

将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照遵循的原则是单一变量，所以与选择培养基一样接种、培养。

【答案】

C 4．请选出下列正确的操作步骤(

) ①土壤取样

②称取10 g土壤，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中

③吸取0.1 mL进行平板涂布

④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度

A．①→②→③→④

B．①→③→②→④

C．①→②→④→③

D．①→④→②→③

【解析】

在分离土壤中某细菌时，应先选取土样(10 g)，然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。

【答案】

C 5．用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是(

) A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230 B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233 【解析】

在菌种计数过程中，同一稀释度下至少应选择三个培养基进行计数，然后取其平均值，所选择的平板上的菌落数应在30～300之间方为有效。

【答案】

D 6．可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是(

) A．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂

B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂

C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂

D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂

【解析】

细菌分解尿素时，会产生氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此在培养基中加入酚红指示剂后，可根据是否变红来鉴定分解尿素的细菌。

【答案】

B 7．(2013·广州高二测试)下表为某微生物培养基的配方，请回答：

成分

NaNO3

K2HPO4

琼脂

含量

3 g 1 g 15 g 成分

FeSO4

(CH2O) H2O 青霉素

含量

0.01 g 30 g 1 000 mL 0.1万个单位

MgSO4·7H2O 0.5 g (1)该培养基中的碳源是____________________，依用途划分，该培养基属于________培养基。不论何种培养基，各成分在溶化分装前，要进行的是________________________________________________________________________。

(2)若用该培养基培养尿素分解菌，应除去的物质是__________________，加入的物质是______________。

(3)为检测尿素分解菌的存在与否，还应加入__________________，将呈______________反应。

(4)细菌种群进化过程中，起主要作用的变异来源是

________________________________________________________________________。

【解析】

该培养基中含有青霉素，可抑制细菌的生长，因此可以选择出真菌，属于选择培养基；若要培养分解尿素的细菌，则需要除去青霉素及其他氮源，同时加入唯一的氮源尿素；细菌属于原核生物，其变异来源主要是基因突变。

【答案】

(1)(CH2O)

选择

先调整pH

(2)青霉素和NaNO3

尿素

(3)酚红指示剂

红色

(4)基因突变