课题3　血红蛋白的提取和分离国家获奖教案

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专题五 课题三 血红蛋白的提取和分离

编制人：黄浩胜 一、课题目标

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

二、课题重点与难点

课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。

课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

温故：

（一）蛋白质

1、含量：占细胞

重的50％以上，细胞中含量最多的

。

2、组成元素：

。

3、相对分子质量：

化合物

4、基本组成单位：

。其结构通式：

。

5、氨基酸连接方式：

。形成

键，书写为：

。

6、蛋白质结构的多样性的原因：

①

；②

；

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③

；④

；

7、生理功能：

。

知新：

(二）血红蛋白的提取和分离

1.分离生物大分子的基本思路：

。

2.蛋白质分离和提取的原理：

。

3、高温灭菌和干热灭菌分别对蛋白质有何种影响，作用结果是什么被破坏？

。

4.血红蛋白用什么生物材料更理想，如果是提取红细胞中DNA又选什么材料？

。

三、基础知识：

㈠、凝胶色谱法（分配色谱法）：

1、凝胶：

。

2、凝胶色谱法概念：

。

3、原理：

当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（

）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（

），移动速度（

），而（

）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（

）移动，路程（

），移动速度（

），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

4:洗脱：

。

㈡

、

缓冲溶液：

1、概念：

。

2、作用：能够抵制（

）的对溶液的（

）的影响，维持PH基本不变。

3、缓冲溶液的配制:通常由（

）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（

）就可以制得（

）使用的缓冲液。

思考：说出人体内环境中缓冲对

。

思考：

1、在血红蛋白提取与分离整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？

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。

2、在生物化学的研究工作，为什么要正确配制缓冲溶液和准确测定缓冲溶液的pH？

。

㈢、电泳：概念

。

1）原理：

。

。

。

思考：蛋白质为什么带有电荷？

。

2）影响蛋白质分子运动速度的因素（打√）

决定

运动方向

电荷性质

电荷量

分子形状

分子大小

电场

作用力

形成

阻力

决定

运动速率

2、常见方法：

和

。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入(

)。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是(

)。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于(

)。

四、蛋白质的提取和分离一般分为四步：

。

（一）样品处理及粗分离

(1)、红细胞的洗涤

①目的：去除（

）

②方法：（

）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（

），将下层（

）的红细胞液体倒入（

）再加入用（

）的（

）(质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤)重复洗涤（

）次，直至上清液中已没有（

），表明洗涤干净。有利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。

(2)、血红蛋白的释放

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加（

）到（

）体积，再加40％体积的（

）（

溶解细胞膜）

，置于（

）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白. (2)血红蛋白的释放（使用蒸馏水和甲苯）

(3)、分离血红蛋白溶液：

将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层:

分别为：

。

(4)透析(粗分离)：

取(

)ml的血红蛋白溶液装入（

）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L（

）中，pH为（

），透析12小时. 目的是（

）或用于更换样品中的（

）。

五、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即（

）；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的（

）；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行（

）。

结果分析与评价

1.描述处理后的样品发生了哪些变化？

。

2.装填的凝胶色谱柱中是否有气泡产生？如何判断的？

3.观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动，请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果。

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