复习与测试教学实录

《微生物的分离和培养》复习教学设计

一、知识整理

1．理清培养基制备与微生物纯化技术

(1)为了确定培养基的灭菌是否合格，微生物学实验一般会设置空白对照：随机取若干灭菌后的空白平板培养基在适宜条件下培养一段时间，观察培养基上是否有菌落生成。

(2)观察菌落需用固体培养基，因此培养基要添加琼脂。

(3)倒平板的温度一般在50 ℃左右，温度过高会烫手，温度过低培养基会凝固。

(4)平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又能防止皿盖上的水珠落入培养基，造成培养基污染。

(5)平板划线法只适用于微生物的提纯，不适合进行计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。

(6)利用稀释涂布平板法估算水样中的活菌数的计算公式：(C÷V)×M(稀释倍数)。

(7)菌种可用甘油管藏法长期保存，保存时菌液中常添加一定量的甘油。

2．微生物分离与计数的两个实例

(1)土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

①筛选菌株：利用以尿素为唯一氮源的选择培养基筛选菌株。

②测定微生物数量的常用方法：活菌计数法和显微镜直接计数法。

③过程：土壤取样→样品稀释→微生物的培养与观察。

④鉴定方法：含酚红指示剂的以尿素为唯一氮源的培养基→细菌→指示剂变红，则该菌能分解尿素。

(2)分解纤维素的微生物的分离

①实验原理：

即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

②流程：土壤取样→选择培养→梯度稀释→涂布平板→挑选菌落。

二、考题集训

1．(2018·全国Ⅰ，37)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：

(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。

(2)M培养基中的铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有________________(答出两点即可)。

(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：

甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；

乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。

有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是________________。

答案

(1)细菌

选择

(2)碳源、无机盐

蛋白质、核酸

(3)碘液

淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈

(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差

解析

(1)链霉素是抗生素，可抑制细菌生长，故在M培养基中加入链霉素作为选择培养基，可筛选出真菌。

(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等，故所加入的氮源可参与以上物质的合成。

(3)能产生淀粉酶的微生物可将淀粉分解成麦芽糖，淀粉遇碘变蓝，向加有淀粉的培养基中加入碘液后培养基呈现蓝色，产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解，形成透明圈，可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的多少。

(4)统计菌落数时一般选择菌落数在30～300个的平板，甲同学统计的3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大，比较准确；乙同学统计的3个平板中，

1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差。

方法技巧

选择培养基作用原理的判断

(1)在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度

的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的“加入”是在主要营养成分完备的基础上进行的。

(2)改变培养基中的营养成分。缺乏氮源时可以分离出固氮微生物；以石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。

(3)改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境下培养，可以得到耐高温的微生物。

2．(2018·全国Ⅱ，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：

(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能______________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。

(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。

(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是____________________。

答案

(1)可以

(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少

(3)破坏DNA结构

消毒液

(4)氯气

(5)未将锅内冷空气排尽

解析

(1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃条件下加热1～2 h。耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法。

(2)巴氏消毒法是在70～75 ℃条件下煮30 min或在80 ℃条件下煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养物质损失较少。

(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。

(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。

(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。

模型构建

三种常用灭菌方法的比较

灭菌方法

灼烧灭菌

干热灭菌

灭菌条件

酒精灯火焰的充分燃烧层

干热灭菌箱内，160～170 ℃

灭菌时间

直至烧红

1～2 h 适用材料或用具

接种环、接种针或其他金属工具

玻璃器皿(吸管、培养皿)

和金属用具等

高压蒸汽灭菌

3.(2016·全国Ⅰ，39)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：

①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；

②制作无菌平板；

③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；

④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题：

(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。

(2)步骤③中，实验组的操作是______________________________________________ ________________________________________________________________________。

(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法________(填“正确”或“不正确”)。

答案

(1)牛肉膏、蛋白胨

琼脂

(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间

(3)污染

不正确

解析

(1)牛肉膏和蛋白胨都可以作为氮源；平板为固体培养基，故需要加入凝固剂琼脂。(2)实验探究的是教室内“不同高度空气”中微生物的分布，其中变量为不同高度，故需在不同高度下放置开盖平板。同时，为了保证单一变量，需要保证开盖放置时间一致。为了保证实验可靠性，需要设置多个平行组。(3)在完全正确的操作情况下，空白对照组中不应出现菌落。若出现菌落，表明操作过程中存在杂菌污染，属于实验失误，所有实验数据均不应采用。

方法技巧

关注两种对照组与一种重复组

(1)将未接种的选择培养基与接种的选择培养基一起培养——用于确认培养基灭菌是否彻底(制备是否合格)。

(2)将接种的普通培养基与接种的选择培养基一起培养——用于确认选择培养基是否起到“筛选”作用。

(3)进行微生物计数时，每一稀释度下涂布三个平板，即设置重复组，是为了求平均值，提高计数准确度。

100 kPa,121 ℃

15～30 min 培养基等

4．(2018·保山第二次统测)李斯特菌广泛存在于各类食品中，李斯特菌在李斯特菌显色培养基上培育时菌落会呈现蓝绿色。在目前发现的16种李斯特菌中单增李斯特菌是唯一对人有致病性的一种，与其他李斯特菌相比，单增李斯特菌还能合成并分泌磷脂水解酶，使培养基中的磷脂被分解而在单增李斯特菌菌落周围出现白色晕环。

(1)与单增李斯特菌相比，其他李斯特菌不能合成并分泌磷脂水解酶的原因是________________________________________________________________________。

(2)现要检测某食品中是否含有其他李斯特菌和单增李斯特菌，进行下列相关实验：

①将该食品样品加入经__________灭菌的李斯特菌选择培养液中培养，培养的目的是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

②将经过培养的菌液用________________进行系列梯度稀释后，利用________________法接种到鉴定李斯特菌的培养基上。鉴定李斯特菌的培养基与李斯特菌选择培养液相比，还需额外添加显色剂、________和________。

③将接种后的培养基置于适宜条件下进行培养。一段时间后若培养基上出现__________________的菌落，则说明该食品中含有单增李斯特菌。

答案

(1)其他李斯特菌不含有控制磷脂水解酶合成的基因

(2)①高压蒸汽

增加李斯特菌的浓度，确保能从样品中分离到所需微生物

②无菌水

稀释涂布平板

磷脂

琼脂

③蓝绿色且周围有白色晕环

解析

(1)根据以上分析可知，单增李斯特菌具有磷脂水解酶基因，而其他李斯特菌不含有控制磷脂水解酶合成的基因，因此其他李斯特菌不能合成并分泌磷脂水解酶。

(2)①将该食品样品加入经高压蒸汽灭菌的李斯特菌选择培养液中培养，以增加李斯特菌的浓度，确保能从样品中分离到所需微生物。②将经过培养的菌液用无菌水进行系列稀释后，利用稀释涂布平板法接种到鉴定李斯特菌的培养基上。鉴定李斯特菌的培养基与李斯特菌选择培养液相比，还需额外添加显色剂、磷脂和琼脂。③若该食品中含有单增李斯特菌，则一段时间后，培养基上会出现蓝绿色且周围有白色晕环的菌落。

5．(2018·太原高三模拟)反刍动物如牛和山羊，具有特殊的器官——瘤胃，瘤胃中生活着多种微生物，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究，请回答下列问题：

(1)在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是________(多选)。

A．酒精灯

B．培养皿

C．显微镜

D．无菌水

E．接种环

(2)向试管内分装含琼脂的培养基时

, 若试管口粘附有培养基

, 需要用酒精棉球擦净的原因是________________________________________________________________________。

(3)刚果红可与________形成红色复合物，研究人员在刚果红培养基平板上，筛选到了几株有透明降解圈的菌落(见图

1)。图中降解圈大小与纤维素酶的________有关。图中降解纤维素能力最强的菌株是______(填图中序号)。

(4)纤维素酶高产菌株在－20 ℃长期保存时，菌液中常需加入一定量的________保藏。

(5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株

A 和

B，在不同温度和

pH 条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果如图

2，推测菌株________更适合用于人工瘤胃发酵，理由是________________________________________________________________________。

答案

(1)CE

(2)避免培养基污染棉塞

(3)纤维素

量与活性

菌2

(4)甘油

(5)B

发酵过程会产热和产酸，B 菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高

解析

(1)在样品稀释中需要使用无菌水稀释；在涂布平板操作中，需要使用酒精灯对涂布器进行灭菌，并在酒精灯火焰旁完成对培养皿涂布接种操作，所以从选项分析可知，显微镜和接种环不需要，故选CE。

(2)分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净以避免培养基污染棉塞。

(3)根据“刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌”，所以在刚果红培养基平板上，可以筛选到有透明降解圈的菌落，降解圈大小与纤维素酶的量和活性有关。纤维素酶的量越多，活性越强，分解的纤维素越多，透明降解圈越大，所以图中降解纤维素能力最强的菌株是菌2。

(4)在－20 ℃长期保存菌株时，菌液中常需加入一定量的甘油保藏。

(5)由于胃部pH值较低，根据题意和图示分析可知，发酵过程会产热和产酸，B菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高，所以推测菌株B更适合用于人工瘤胃发酵。

6.(2018·新乡高三第二次模拟)回答下列与微生物的培养与应用有关的问题：

(1)微生物的培养需要使用培养基，不同培养基的配方不同，但一般都具有____________________。在配制从土壤中筛选纤维素分解菌的培养基时，需加入__________

作为唯一的碳源。

(2)下图中产生每个菌落的最初细菌数为________个才是最理想的。据图分析，在培养基上划线接种时，划线的顺序依次是________(用编号和箭头表示)。

(3)根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数就能大概推测出样品中的活菌数。某同学在稀释倍数为104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为25.6，则每毫升样品中的活菌数是________个(所用稀释液的体积为0.2 mL)。

(4)若要鉴别纤维素分解菌，可用________________法；若要鉴别尿素分解菌，可在培养基中加入____________。

答案

(1)碳源、氮源、水和无机盐

纤维素

(2)1 ②→③→①

(3)1.28×106

(4)刚果红染色

酚红指示剂

解析

(1)培养微生物的不同培养基，虽然其配方不同，但一般都具有碳源、氮源、水和无机盐。在配制从土壤中筛选纤维素分解菌的培养基时，需加入纤维素作为唯一的碳源。

(2)图示中产生每个菌落的最初细菌数为1个才是最理想的。采用平板划线接种时，通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，在数次划线后，就可以得到单菌落，据此分析图示可知：划线的顺序依次是②→③→①。

(3)所用稀释液的体积为0.2 mL，在稀释倍数为104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为25.6，则每毫升样品中的活菌数是25.6×104÷0.2＝1.28×106(个)。

(4)刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应，因此若要鉴别纤维素分解菌，可用刚果红染色法。在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此若要鉴别尿素分解菌，可在培养基中加入酚红指示剂。