课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学实录与评析

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

柳林县联盛中学 高卫廷

1．研究培养基对微生物的选择作用。

2．进行微生物数量的测定。

一、研究思路

1．筛选菌株

尿素是一种重要的农业____肥，但不能直接被农作物吸收利用，只有当土壤中的细菌将尿素分解成____之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成______。

（1）实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的______生长的条件（包括营养、______、pH等），同时______或______其他微生物生长。

（2）选择培养基：在微生物学中，将允许________的微生物生长，同时______或______其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

2．统计菌落数目

（1）常用来统计样品中______数目的方法是________。即当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的________。通过统计平板上的________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数。

统计的菌落数往往比活菌的实际数目____。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用________来表示。

（2）____________也是测定微生物数量的常用方法。

（3）细菌的数目还可以通过______法来测定。例如，测定饮用水中大肠杆菌的数目，可将________的水过滤后，将滤膜放到________培养基上培养，大肠杆菌的菌落呈现____色，可以根据培养基上________的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。

3．设置对照

（1）设置对照的主要目的是排除实验组中__________对实验结果的影响，提高实验结果的________。

（2）对照实验是指除了________的条件以外，其他条件都______的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

二、实验设计

实验设计包括对实验方案，所需仪器、材料，用具和药品，具体的________以及时间安排等的综合考虑和安排。关于土壤中某样品细菌的分离与计数的实验操作步骤如下：

1．土壤取样

土壤中的微生物70%～90%是_____，绝大多数分布在距地表______ 的近____性土壤中。

2．样品的稀释

样品的________将直接影响平板上生长的菌落数目。通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在________之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用____________倍的稀释液进行平板培养。第一次实验时，可将稀释范围放宽一点，以保证能从中选择出适于计数的平板。

3．微生物的培养与观察

不同种类的微生物，往往需要不同的培养______和培养______。细菌一般在30～37 ℃的温度下培养1～2 d，放线菌一般在25～28 ℃的温度下培养5～7 d，而霉菌一般在25～28 ℃的温度下培养3～4 d。

在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目。选取____________时的记录作为结果，

以防止因____________而导致遗漏菌落的数目。

一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征。菌落的特征包括______________和______等方面。

思考：土壤有“微生物的天然培养基”之称，为什么？

三、操作提示

1．无菌操作

2．做好标记

3．制定计划

四、对分离得到的分解尿素的细菌的鉴定

1．在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的______将尿素分解成了____。氨会使培养基的碱性______，pH______。因此，可以通过检测培养基

____的变化来判断该化学反应是否发生。

2．在以______为唯一氮源的培养基中加入______指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变____，说明该种细菌能够________。

答案：一、1.氮

氨

脲酶

（1）菌株

温度

抑制

阻止

（2）特定种类

抑制

阻止

2．（1）活菌

稀释涂布平板法

一个活菌

菌落数

30～300

低

菌落数

（2）显微镜直接计数

（3）滤膜

已知体积

伊红美蓝

黑

黑色菌落

3．（1）非测试因素

可信度

（2）被测试

相同

二、实施步骤

1．细菌

3～8 cm

中

2．稀释程度

30～300

104、105、106

3．温度

时间

菌落数目稳定

培养时间不足

形状、大小、隆起程度

颜色

思考：由于土壤具备了各种微生物生长所需的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，是微生物生活的良好环境。

四、1.脲酶

氨

增强

升高

pH

2．尿素

酚红

红

分解尿素

题型一

选择培养基的特点与应用

【例题1】

（2009·上海高考）氯苯化合物是重要的有机化工原料，因其不易降解，会污染环境。某研究小组依照下列实验方案（图1）筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培养基配方如下表。

图1 培养基的组成

液体培养基

Ⅰ号

Ⅱ号

蛋白胨

10 g —

牛肉膏

5 g —

氯苯

氯化钠

硝酸铵

5 mg 5 g —

50 mg 5 g 3 g 20～80 —

—

5 g 3 g 1 L Ⅲ号

适量

mg （1）配制Ⅱ号固体培养基时，除添加Ⅱ号培养基成分外，还应添加1%的________。

（2）培养基配制时，灭菌与调pH的先后顺序是________________________________ ________________________________________________。

无机盐蒸馏水

（无碳）

—

1 L 1 L 适量

（3）从用途上来说，Ⅰ号培养基和Ⅱ号培养基分别属于________培养基和________培养基。在Ⅱ号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是________。

（4）在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为________。

（5）将SP1菌接种在含不同浓度氯苯的Ⅲ号培养液中培养，得到生长曲线（如图2）。从图2可知，SP1菌在________培养条件下最早停止生长，其原因是____________________ _____________________________________________________________________________。

图2 解析：（1）固体培养基必须含有适量的琼脂。（2）配制培养基时应先调pH后灭菌。（3）Ⅰ号培养基是为了获得更多的菌株，属于通用培养基，Ⅱ号培养基是为了选择出SP1菌株，属于选择培养基，Ⅱ号培养基成分中含N物质为硝酸铵，则应由它为SP1菌株提供氮源。（4）在恶劣环境下一些菌体会形成芽孢休眠体，来度过不良环境。（5）SP1菌株是以氯苯为碳源，当氯苯消耗尽菌株因缺少碳源而不能继续生存，故氯苯含量越少，SP1菌株越早停止生长。

答案：（1）琼脂

（2）先调pH，后灭菌

（3）通用

选择

硝酸铵

（4）芽孢

（5）－120 mg·L氯苯

碳源最早耗尽

题型二

测定细菌数量的原理与方法

【例题2】

用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，

得到以下几种统计结果，正确的是（

）。

A．涂布了1个平板，统计的菌落数是230 B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233 解析：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B两项不正确。C项虽涂布了3个平板，

但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地用3个平板的计数值求平均值。

答案：D 反思领悟：在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组；在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，如果结果差别过大，则意味着操作有误，需重新实验。

题型三

设计微生物的选择方案

【例题3】

用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是（

）。

A．未接种的选择培养基

B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基

C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基

D．接种了的选择培养基

解析：将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，以牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照遵循的是单一变量原则，所以与选择培养基一样接种、培养。

答案：C 反思领悟：对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照实验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

1．下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是（

）。

A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上

C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

2．若大肠杆菌和圆褐固氮菌混合在一起，采用下列哪组培养基可将它们分离？（

）

A．加食盐的培养基和牛肉膏蛋白胨培养基

B．伊红美蓝培养基和无氮培养基

C．斜面培养基和液体培养基

D．加青霉素的培养基和液体培养基

3．分析下面培养基的配方，回答下面的问题。

KH2PO4

1.4 g Na2HPO4

2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 10.0 g 葡萄糖

1.0 g 尿素

15.0 g 琼脂

用蒸馏水定容到1 000 mL （1）在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是________和________。

（2）按物理性质划分该培养基属于________培养基，理由是培养基中含有________；该类培养基常用于微生物的纯化、________和________。

（3）由于培养基中只有尿素一种______源，所以该培养基只能用于能够合成________的微生物的培养。用此培养基培养土壤浸出液能够从土壤中筛选出________细菌。

（4）在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，并能抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作________培养基。

4．（2011·课标全国理综）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答下列问题。

（1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于________培养基。

（2）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即________和________。

（3）为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力________________________________________________________________________。

（4）通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和________。无菌技术要求实验操作应在酒精灯________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。

答案：1．D

检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h，在确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的一组平板为代表进行计数。

2．B

大肠杆菌的代谢产物可与伊红美蓝结合，使菌落呈黑色，圆褐固氮菌能自行固氮，可用无氮培养基选择。

3．解析：（1）碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质。所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。（2）根据物理性质可以将培养基分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基，固体培养基中添加了琼脂作凝固剂，常用于微生物的纯化、分离和计数。（3）绝大多数生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，所以此培养基对微生物有选择作用，选择对象是能够利用尿素的微生物。

答案：（1）葡萄糖

尿素

（2）固体

凝固剂琼脂

分离

计数

（3）氮

脲酶

分解尿素的

（4）选择

4．

答案：（1）原油

选择

（2）平板划线法

稀释涂布平板法

（3）强

（4）干热灭菌

高压蒸汽灭菌

火焰