课题3　血红蛋白的提取和分离优质课教案整理

专题5 DNA和蛋白质技术

课题3 血红蛋白的提取和分离

班级 学习小组 姓名 组内评价 教师评价 学习目标：

1.掌握蛋白质分离的方法凝胶色谱法的原理、缓冲液的制备及作用和蛋白质纯度鉴定方法电泳法的原理。

2.掌握蛋白质提取和分离的过程以及分离过程中需注意的问题。

3.热爱自然，珍爱生命，激情投入，享受学习的快乐。

重难点：

1.尝试提取和分离血液中的血红蛋白，体验提取生物大分子的基本过程和方法。2.了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

预习案

使用说明及学法指导：

1.阅读教材P64“基础知识”，掌握蛋白质分离的方法凝胶色谱法的原理、缓冲液的制备及作用和蛋白质纯度鉴定方法电泳法的原理。分析教材P66“实验操作”，掌握蛋白质提取和分离的过程。阅读教材P69“操作提示”，掌握蛋白质分离过程中需注意的问题。划出重点，然后再读教材或查阅资料，完成教材助读部分。

2.本节聚焦：凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

教材助读

一、回忆必修一、必修三中有关知识，教材P64“课题背景”，教材P64、P67正文第一段，回答下列问题：

1.归纳蛋白质多样性的原因

2.血液包括血细胞和血浆，血细胞又分为红细胞、白细胞和血小板，其中哪种血细胞含有血红蛋白？怎样使红细胞放释放出血红蛋白？

3.血红蛋白的功能是什么？为什么具有这样的功能？

4.血浆中维持PH相对稳定的物质是哪些？

5.在教材中划出蛋白质特性的差异所包含的内容。并记忆。

二、蛋白质分离技术

(一)分离的方法

1.生物体内的蛋白质多种多样，按照科学的需要有时要把它们分开，分离蛋白质使用的方法是什么？其分离蛋白质的依据是什么？

2.大多数凝胶的构成成分是什么？

3. 分析教材P64以及图5-13分离蛋白质的过程，理解并记住图5-13顺序。完成下表

相对分

直径大小（与凝胶颗运动

运动

从凝胶柱洗脱运动场所

子质量

粒空隙直径比较）

速度

路程

出来的次序

(二)缓冲溶液

1. 缓冲溶液有何作用？本实验为什么要使用缓冲溶液？

2.怎样配制不同pH范围内使用的缓冲液？

(三)电泳

1. 电泳分离样品中各种分子的原理是什么？在电场的作用下，带电分子会向着那个电极移动？

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2.常用电泳方法哪两种？蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率取决于什么？

3.在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS有何作用？

三、血红蛋白的提取和分离。

★蛋白质的提取和分离一般分为哪四步？

(一)样品处理及粗分离

1.红细胞的洗涤

(1)洗涤红细胞时应怎样离心？每次离心后应保留上层液体还是下层沉淀？

(2)红细胞洗涤的目的是什么？怎样判定红细胞已洗涤干净？

(3)为什么用生理盐水而不是蒸馏水洗涤红细胞？

2.血红蛋白的释放

(1)将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，其作用是什么？

(2)加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜；

(3)置于磁力搅拌器上搅拌10 min，其作用是什么？

3.分离血红蛋白溶液

(1)将搅拌好的混合液转移到离心管中离心，这与洗涤红细胞时的离心有何区别？

(2)离心后试管中的溶液分为4层，我们需要第几层？完成下表并记忆。

(3)将试管中的液体怎样处理可得到血红蛋白溶液？

4.透析

(1)透析的目的什么？

(2)透析袋内、外分别是什么液体？

(3)透析后，血红蛋白保留在透析袋袋内还是进入缓冲液？

(二)凝胶色谱柱操作

1.阅读教材P67以及图5-19了解凝胶色谱柱的制作过程。

2.凝胶色谱柱的装填

(1)本实验实验的Sephadex G-75。其中G、75分别有何含义？

(2)将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热有何优点？

(3)装填时凝胶色谱柱下端的尼龙管应打开还是关闭？

(4)能否将凝胶悬液分多次装填入色谱柱内？怎样判断凝胶装填均匀？

(5)在50cm高的操作压下，用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗涤平衡凝胶12 h，目的是什么？

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3.样品的加入和洗脱（纯化）。阅读教材P68以及图5-22 记住操作顺序。

(1)加样前打开出口的目的是什么？加样后打开出口的目的是什么？

(2)什么时候开始收集？为什么？

(3)怎样判断凝胶色谱柱制作成功？

(三)纯度鉴定

1.进行蛋白质纯度的鉴定的目的是什么？

2. 使用最多的鉴定方法是什么？

预习自测

1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质(

) A.路程较长，移动速度较慢 B.路程较长，移动速度较快

C.路程较短，移动速度较慢 D.路程较短，移动速度较快

2.下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因(

) A.分子带电性质的差异 B.分子的大小 C.分子的形状 D.分子的变性温度

3.下列说法不正确的是(

) A.在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变

B.缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成

C.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

D.透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内

4.在血红蛋白分离过程中，使用缓冲液的作用是(

) A.维持溶液浓度不变 B.维持溶液酸碱度不变

C.催化蛋白质分离过程顺利完成 D.无实际意义

5.凝胶色谱柱制作成功的标志是(

) A.凝胶装填紧密、均匀 B.凝胶色谱柱中有气泡

C.洗脱中，红色区带均匀一致地移动 D.洗脱中，红色区带偏向左边移动

6.下列关于蛋白质提取和分离实验中样品处理步骤的叙述，正确的是(

) A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心

B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌

C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心，过滤后，用分液漏斗分离

D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h 【我的疑问】（发现问题比解决问题更重要）

探究案

探究点一：本实验为什么选择提取和分离血液中的血红蛋白？

探究点二：红细胞的洗涤时离心离心转速要低，时间要短，否则会造成什么后果？

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知识链接

1.缓冲溶液常见的有三类

(1)弱酸及其对应盐，如CH3COOH—CH3COONa，H2CO3—NaHCO3。

(2)多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐，如：NaHCO3—Na2CO3，NaH2PO4—Na2HPO4。

(3)弱碱及其对应盐，如NH3·H2O—NH4Cl。

2.凝胶色谱法和电泳法

凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来，而小分子后分离出来。电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。

课本讨论、练习答案

（一）旁栏思考题

你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？

答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

（二）练习

1．答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。

2．答：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。

缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。

3．答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

4．答：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

5．答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

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专题5 DNA和蛋白质技术

课题3 血红蛋白的提取和分离

部分参考答案

教材助读

一、1.答案

氨基酸的种类不同，氨基酸的数目不同，氨基酸的排列次序不同，构成的肽链不同。肽链的数目和空间结构不同，构成的蛋白质不同。

二、蛋白质分离技术

(一)3. 答案

相对分

运动

运动

从凝胶柱洗脱直径大小

运动场所

子质量

速度

路程

出来的次序

先从凝胶柱洗大

大于凝胶颗粒空隙直径

在凝胶颗粒的外面

较快

较短

脱出来

后从凝胶柱洗小

小于凝胶颗粒空隙直径

进入凝胶颗粒内部

较慢

较长

脱出来

(三)3.答案 使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；SDS能与各种蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

三、 (一)3.答案

(3)将试管中的液体怎样处理可得到血红蛋白溶液？

答案

将试管中的液体用滤纸过滤、除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的红色透明液体，即血红蛋白溶液。

(二)凝胶色谱柱操作

在50cm高的操作压下，用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗涤平衡凝胶12 h，目的是什么？

答案 使凝胶装填紧密

(三)纯度鉴定

1.进行蛋白质纯度的鉴定的目的是什么？

答案 判断纯化的蛋白质是否达到要求

预习自测

1.D 2.D 3.D 4.B 5.C 6.C 探究案

探究点一：答案 血红蛋白呈现红色，便于观察。

探究点二：答案 红细胞的洗涤中离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。

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