课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计(第二课时)

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、研究思路

1．筛选菌株

(1)原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

(2)选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

2．统计菌落数目

(1)常用方法：稀释涂布平板法。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

(2)测定微生物数量的常用方法还有显微镜直接计数法。

3．设置对照：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

二、实验设计

土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察

1．土壤取样一般要铲去表层土，因为绝大多数细菌分布于距地表约

3～8_cm的土壤层。

2．样品的稀释：不同的微生物需要稀释的倍数不同。(填表) 微生物

稀释倍数

细菌

104、105、106

放线菌

103、104、105

真菌

102、103、104

3.微生物的培养与观察

(1)培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

(2)观察：每隔24_h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

三、操作提示

1．无菌操作：取土样用的小铁铲和盛土样的信封都要进行灭菌；称取土样要在火焰旁进行，稀释样品要在火焰旁操作。

2．做标记：对平板和试管进行标记，尤其进行系列稀释时要按照稀释度递增的顺序将试管排列成行。

3．制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率。

四、菌种鉴定

1．原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强。

2．方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。

探究点一

[共研探究]

1．筛选菌株

分析下表所示培养基的配方，回答下列问题：

成分

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 含量

1.4 g 2.1 g 0.2 g 筛选微生物的研究思路

1．尿素能被尿素分解菌分解的原因是什么？

2．筛选菌落和统计菌落数目的方法及对照实验的设计方法是什么？

3．如何利用选择培养基分离细菌？

4．样品如何进行稀释？如何测定分解尿素的细菌数量？

5．脲酶的检测方法是什么？

成分

葡萄糖

尿素

琼脂

含量

10.0 g 1.0 g 15.0 g 将上述物质溶解后，用自来水定容到1 000 mL (1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的物质是葡萄糖，提供氮源的物质是尿素。

(2)该培养基是否具有选择作用，为什么？

2．统计菌落数目

(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

(2)要设置对照实验，且一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。

(3)用此种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

(4)活菌数的计算方法(公式)：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。C表示某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V表示涂布平板时所用的稀释液的体积；M表示稀释倍数。

3．设置对照

教材P22～23提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因？

提示：方案一：其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

[总结升华]

1．微生物的筛选

(1)选择培养微生物的两种方法

①可利用该分离对象对某种营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，并且使该营养物质成为培养基中某类基本营养物质的唯一供给者。如筛选能分解尿素的细菌，就可将尿素作为培养基中的唯一氮源。

②可利用该分离对象对某种抑菌物质的抗性，在混合培养物中加入该抑菌物质，经培养后，其他微生物生长受到抑制，而该分离对象却可乘机大量增殖，在数量上占据优势。

(2)常见的选择培养基

①将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。

②以石油为唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。

③不含有机碳源的培养基可以分离自养型微生物。

④无氮源培养基可以分离固氮微生物。

⑤加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

⑥加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

2．统计菌落数目的方法

微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如表所示：

项目

直接计数法

间接计数法

当样品的稀释度足够高时，培养基表利用特定血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量

面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌

主要用具

计数依据

优点

缺点

计算公式

显微镜、血细胞计数板

菌体本身

计数方便、操作简单

死菌、活菌都计算在内

每毫升原液含菌数＝400×104×每小格平均菌体数×稀释倍数

①原理

培养基

培养基上菌落数

计数的是活菌

操作较复杂，有一定误差

每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数÷涂布液体积×稀释倍数

注：①400、104是常数。

3．实验设计原则

(1)单一变量原则。对照实验中除测试因素(自变量)不同外，其他因素要保证和实验组相同。

(2)平行重复原则。任一稀释度至少涂布3个平板，以增强实验结果的可信度与准确性。

(3)对照原则。

①判断培养基是否有杂菌污染，需要将未接种的相同培养基在相同条件下同时进行培养。

②判断培养基是否起到了筛选的作用，需要同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行同样接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目是否有显著差异。

探究点二

[共研探究]

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数操作流程分析(填图)

[总结升华]

1．选择培养基与鉴别培养基

项目

特殊成分

目的

用途

选择培养基

加入某种化学物质

抑制其他微生物生长，促进目的微生物生长

培养、分离出特定微生物

培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入举例

青霉素，抑制细菌生长；用以尿素作唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌

2.结果分析与评价

内容

结论分析

①空白对照组培养基上无菌落生长→未被杂菌污染；②空白对照组培养是否有杂菌污染

基上有菌落生长→被杂菌污染；③实验组选择培养基上菌落形态多样，菌落数偏高→培养基上可能混入其他氮源

选择培养基是否具有筛选作用

样品的稀释操作

重复组的结果

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目明显多于选择培养基上的菌落数目→选择培养基具有筛选作用

如果得到了2个或2个以上菌落数在30～300的平板→操作成功

若选取的是同一种土样，统计的结果应该接近

鉴别培养基

加入某种指示剂或化学药品

与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应

鉴别不同的微生物

可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈黑色) 实验设计与操作