课题3　分解纤维素的微生物的分离教案1

课题3

血红蛋白的提取和分离

第二课时

生动

教师组织与引导

教图

复习提问：凝胶色谱法和凝胶电泳法有何区别？生答：略

师总结；从蛋白质分子的作用力看：凝胶色谱法依靠重力分离，凝胶电泳法依靠电场力分离；从洗脱的先后顺序看：凝胶色谱法首先洗脱出来的是大分子的蛋白质；凝胶电泳法首先洗脱出来的是小分子的蛋白质。

引言：血红蛋白的提取和分离的实验操作是怎样进行的呢？

--引导学生阅读教材P66<实验操作>,并完成学案: 二、实验操作：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

（一）样品处理

红细胞中有一种非常重要的蛋白质—血红蛋白，它有4个肽链组成，包括两个α肽链和两个β-肽链，其中每条肽链环绕一个亚铁血红蛋白基团，此基团可携带一分子氧或一分子的CO2。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。

师讲述：猪、牛、羊或其他脊椎动物的红细胞中都含有大量的血红蛋白。因此，我们可以用猪血、牛血、羊血等用来提取和分离血红蛋白。

师：选用猪、牛、羊的血液来分离血红蛋白，有什么优点？

生答：没有细胞核，使分离过程中要除去的杂质大大减少，使实验更容易成功。

引言：提取和分离血红蛋白的第一步是收集血红蛋白溶液。即样品处理。包括三个步骤：

1、

红细胞的洗涤。目的： 。

操作：血液样品（加入 ，防止 ）

↓低速短时间离心（500r/min、2min）

红细胞液

↓加入生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液）、搅拌、低速短时间离心

重复洗涤三次

↓

红细胞（洗涤干净）

思考：①、红细胞洗涤的目的是什么？生答：去除杂蛋白。

②、获取血液样品时，在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠，目的是什么？生答：防止血液凝固。

③、洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？

生答：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不致于使红细胞吸水破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，会使血红蛋白与杂质蛋白混合，加大了分离的难度。

④、洗涤时，要做到搅拌、低速短时间离心、

重复洗涤三次。如果洗涤次数过少，会出现什么结果？离心的目的是什么？离心速度过高和时间过长，又会出现什么结果？

生答：无法除去血浆蛋白；将血液分层，便于用胶头吸管吸出黄色血浆；使白细胞、血小板等一同沉淀，达不到分离的效果

2．血红蛋白的释放

操作：红细胞（洗涤干净）

↓加 和 红细胞破裂，释放出血红蛋白

↓

含血红蛋白的混合液

思考：在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？

生答：加入蒸馏水使红细胞吸水胀破，释放出血红蛋白；细胞膜的主要成分是磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂。加入甲苯可加速红细胞的破裂，释放出血红蛋白。

3．分离血红蛋白溶液

操作：含血红蛋白的混合液

↓高速离心（2000r/min、10min）

溶液分层（4层，从上到下依次是：无色透明的甲苯层、白色的脂溶性物质沉淀层、血红蛋白溶液、其他杂质的暗红色沉淀物）

↓滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层

↓分液漏斗

血红蛋白溶液（红色透明）

思考：获取血红蛋白溶液后，高速离心的目的是什么？

生答：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于分离出血红蛋白溶液。

引言：获取血红蛋白溶液，下一步要对其进行粗分离。

（二）粗分离 方法： 目的： 原理： 操作：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲认中（pH为7。0），透析12h。

思考：粗分离的方法、目的、原理是什么？

生答：方法是透析。目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质。原理是透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

（三）纯化 方法： 目的： 。

1．凝胶色谱柱的制作（了解、学生自学）

2．凝胶色谱柱的装填

操作：交联葡聚糖凝胶（G—75）→用蒸馏水溶胀→凝胶悬浮液→倒入色谱柱内装填→连接缓冲溶液洗脱瓶→用磷酸缓冲液（物质的量浓度为20mmol/L，pH为7.0）充分洗涤平衡

注意：使凝胶装填紧密、均匀，色谱柱内不能有气泡存在。（气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果）

思考：㈠、纯化的方法及目的是什么？生答：方法：凝胶色谱法。

目的：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。

㈡、凝胶色谱柱的装填有什么要求？为什么？

生答：①尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；②不得有气泡存在,气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；③凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒现象。

㈢商品凝胶是干燥颗粒，应如何使用？有何优点？

生答：使用前需直接放在洗脱液中膨胀，为了加速膨胀可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾1-2h。优点：不但节约时间，还可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。

3．样品的加入和洗脱

加样品：用吸管将透析后的样品贴着管壁加样，注意不要破坏凝胶面

↓

样品渗入凝胶床内

↓

加磷酸缓冲液（物质的量浓度为20mmol/L，pH为7.0）

↓

连接缓冲溶液洗脱瓶，进行洗脱

↓

收集血红蛋白（红色）

思考：1、在凝胶色谱操作过程中，需要注意什么问题？

生答：不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。否则，凝胶色谱柱需要重新装填。

如何判断色谱柱制作成功？

生答：在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀、狭窄、平整、缓慢一致地移动，说明色谱柱制作成功。

（四）纯度鉴定（选学----学生自学）

方法：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

思考：纯度鉴定后的结果如何分析？（如右上图所示：与标准血红蛋白样液的比较：说明血红蛋白的分子质量是30KDa）

操作提示：略（实验操作中应注意的问题，在蛋白质的提取和分离中已经分析，学生自学）

小结：略 板书设计：略 达标测评：略