课题3　血红蛋白的提取和分离课件配套优秀教案设计

认认真真学习，踏踏实实做事。

姓名

班级

审定：

高二生物组

课题3

血红蛋白的提取和分离

【学习目标】

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

【学习重点】凝胶色谱法的原理和方法。

【学习难点】样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【学习过程】

1．凝胶色谱法

凝胶色谱法也称做

，是根据

分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由

构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质

进入凝胶内部的通道，路程

，移动速度

；而相对分子质量

的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在

移动，路程

，移动速度

。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

2．缓冲溶液

缓冲溶液的作用是

。缓冲溶液通常由

溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是

，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。

3．电泳

电泳是指

。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上

。在电场的作以及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生不同的

，从而实现样品中各种分子的分离。

两种常用的电泳方法是

和

，在测定蛋白质分子量时通以及

等因素。

4．蛋白质的提取和分离

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

、

、

和

。

5．样品处理

血液由

和

组成，其中红细胞最多。红细胞具有

的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质

，其作用是

，血红蛋白有

个肽链组成，包括

，其中每条肽链环绕一个

，磁基团可携带

。血红蛋白因含有

呈现红色。

红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的是

，采集的血

1 用下，这些带电分子会向着与其所带电荷

的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子

常使用

。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于

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样要及时采用

分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的

，将下层暗红色的

倒入烧杯，再加入

，缓慢搅拌

，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至

，表明红细胞已洗涤干净。

血红蛋白的释放

在

和

作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

分离血红蛋白溶液

将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的

，第2层为白色薄层固体，是

，第3层是红色透明液体，这是

，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

透析

取1mL的血红蛋白溶液装入

中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的

中，透析12h。透析可以去除样品中

的杂质，或用于更换样品的

。

6．凝胶色谱操作

第一步要制作

，第二步要

，因为

，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有

存在。因为气泡会

，降低分离效果。第三步是

。

【疑难点拨】

1．凝胶色谱法分离蛋白质的原理

凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空袭时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。

2．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义

哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

3．电泳的作用及其原理

电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

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【典例解析】

用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（

D

）

A路程较长，移动速度较慢

B路程较长，移动速度较快

C路程较短，移动速度较慢

D路程较短，移动速度较快

解析：在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

[课堂练习] 一．选择题

1．凝胶色谱法是根据（

）分离蛋白质的有效方法。

A分子的大小

B相对分子质量的大小

C带电荷的多少

D溶解度

2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。

A温度

B

pH

C渗透压

D氧气浓度

3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（

）的电极移动。

A相同

B相反

C相对

D相向

4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（

）与氧气的运输有关。

A血红蛋白

B肌红蛋白

C肌动蛋白

D肌球蛋白

5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（

）的含量最多。

A白细胞

B血小板

C红细胞

D淋巴细胞

6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（

）。

A.

NaCl

B.甲苯

C.蒸馏水

D.柠檬酸钠

7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（

）

A无色透明的甲苯层

B脂溶性物质的沉淀层

C血红蛋白的水溶液

D其他杂质的暗红色沉淀物

二．非选择题

1．电泳利用了待分离样品中各种分子

以及

、

的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。

【课本问题答案和提示】（一）旁栏思考题

你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？

答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，

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就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

（二）练习

1．答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。

2．答：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。

缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。

3．答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

4．答：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

5．答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作参考资料

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