附录4　常用的消毒灭菌操作方法第二课时 公开课

常用的消毒灭菌操作方法

一．教材分析

本部分内容属于微生物培养中关于无菌技术知识的拓展，前面教材中主要介绍无菌技术及实验室常用的消毒和灭菌的方法，但是给学生一个高压蒸汽灭菌锅和干热灭菌箱，学生是不会操作的。也就是说学生没掌握具体操作步骤和方法，生物科学是一门以实验为基础的学科，光靠知道原理是不行的，要综合提高学生的科学素养，因此，有必要为学生讲解本部分内容。

二．学情分析

高三学生学到后期，知识储备已经较多，能够通过视频及文字描述能够知道起原理及原因，对本节内容的学习应该是没有压力，但是能不能记住知识还需要强化记忆。

三．教学目标

1．知识目标

（1）进一步掌握为什么要无菌操作及消毒和灭菌的概念。

（2）认识高压蒸汽灭菌锅及干热灭菌箱的构造

（3）掌握操作方法

2．能力目标

（1）学会高压蒸汽灭菌锅的使用方法

（2）学会干热灭菌箱的使用方法

3．情感态度价值观

（1）通过观看视频中灭菌的操作及注意事项，提高学生对待实验操作时的严谨态度

（2）提高学生的卫生习惯

四．教学重难点

1．重点：灭菌消毒方法

2．难点：掌握实验室常用的消毒灭菌操作方法

五．课时安排：1课时

六．教学过程

导入新课：

一．为什么要消毒灭菌

19世纪中期

关系到法国经济命脉的酿造业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中

出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。为什么？

早期，麻醉、止血和抗感染三大技术尚未建立。为了拯救生命，医生只能不顾病人的极大痛苦去切割肢体，用炽热的铁器烙印切口来止血，再缠上一条条“脏”布，或让血肉模糊的伤口直接暴露在空气中。病人如果侥幸不死于鲜血淋漓、痛不可忍的“手术”，那么，绝大多数也要死于手术后的伤口化脓！为什么伤口化脓？

某同学课间操在小摊上购买了肉夹馍，吃完后，出现上吐下泻，一天跑了N次卫生间。为什么？

二．什么是消毒？什么是灭菌

1.消毒：使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）

2.灭菌：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子

三.常用的消毒方法

1.煮沸：煮沸10～20 min可杀死所有细菌的繁殖体，芽胞常需煮沸1～2h才被杀死。用于

饮水、一般器械，如刀剪的消毒。

2.巴氏消毒法：以较低温度杀灭液态食品中的病原菌或特定微生物，而又不致严重损害其营养成分和风味的消毒方法.主要用于葡萄酒、啤酒、果酒及牛乳等食品的消毒。

a.低温维持巴氏消毒法

61～63℃30min

b.高温瞬时巴氏消毒法

71～72℃15s

c.超高温巴氏消毒法

132℃1～2s

3.阳光

直射日光有强烈的杀菌作用，是天然的杀菌因素。许多微生物在直射日光的照射下，半小时到数小时即可死亡。芽胞对日光照射的抵抗力比繁殖体大得多，往往需经20h才死亡。日光的杀菌效力因地、因时及微生物所处环境不同而异

。

4.紫外线

紫外线中波长200-300nm部分具有杀菌作用，其中以265-266nm段的杀菌力最强，这与DNA吸收光谱范围一致。常用的紫外线杀菌灯波长为

253.7nm，杀菌力强而稳定。

缺点

紫外线的穿透力不强，即使是很薄的玻璃也不能透过，所以只用物体表面消毒。

用途

微生物实验室、无菌室、手术室、传染病房、种蛋室等的空气消毒。

原理

紫外线照射后，DNA分子吸收约260nm紫外线，使同一条DNA链上相邻胸腺嘧啶产生共价结合成二聚体，影响DNA复制与转录，引起致死性突变而死亡。此外，紫外线可使空气中分子氧变为臭氧，臭氧放出氧化能力强的原子氧，呈现杀菌作用。

5.干燥

A．作用：微生物在干燥的环境中失去水分，新陈代谢障碍，菌体蛋白变性，逐渐死亡。

微生物对干燥的抵抗力差异很大。巴氏杆菌、嗜血杆菌、鼻疽杆菌等在干燥的环境中仅能存活几天，而结核杆菌能耐受干燥90d。霉菌的孢子对干燥也有较强的抵抗力。

B．用途：微生物在干燥环境中不能生长繁殖，常用干燥法来保存食品、饲料、谷类、皮张、药材等。利用高浓度的盐水或糖水保存食品，高渗溶液吸取菌体水分，造成生理干燥而抑菌。

四．常用的灭菌方法

1.灼烧灭菌：将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌，此外在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。

2.干热灭菌

是指用高温干热空气灭菌的方法。该法适用于耐高温的玻璃和金属制品以及不允许湿热气体穿透的油脂（如油性软膏机制、注射用油等）和耐高温的粉末化学药品的灭菌，不适合橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。

在干热状态下，由于热穿透力较差，微生物的耐热性较强，必须长时间受高温的作用才能达到灭菌的目的。因此，干热空气灭菌法采用的温度一般比湿热灭菌法高。为了保证灭菌效果，

一般规定：135-140摄氏度灭菌3-5h；160-170摄氏度灭菌2-4h；180-200摄氏度灭菌0.5-1h。

视频展示干热灭菌箱的使用方法及注意事项

操作方法

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一、装入待灭菌物品

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将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电烘箱内，物品不要摆得太挤，以免妨碍热空气流通。同时，灭菌物品也不要与电烘箱内壁的铁板接触，以防包装纸烤焦起火。

二、升温

关好电烘箱门，插上电源插头，拨动开关，旋动恒温调节器至红灯亮，让温度逐渐上升。如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内已停止加温，此时如果还未达到所需的160-170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度

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三、恒温

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当温度升到160-170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度3~4小时。

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四、降温

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切断电源，自然降温。

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五、开箱取物

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待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。

电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门，以免玻璃器皿炸裂。

3. 高压蒸汽灭菌

高压蒸汽灭菌，用高温加高压灭菌，不仅可杀死一般的细菌、真菌等微生物，对芽胞、孢子也有杀灭效果，是最可靠、应用最普遍的物理灭菌法。主要用于能耐高温的物品，如培养基、金属器械、玻璃、搪瓷、敷料、橡胶及一些药物的灭菌。高压蒸气灭菌器的类型和样式较多，如：①下排气式压力蒸气灭菌器是普遍应用的灭菌设备，压力升至103.4kPa（1.05kg/cm2），温度达121.3°C，维持15~20分钟，可达到灭菌目的。②脉动真空压力蒸气灭菌器已成为目前最先进的灭菌设备。灭菌条件要求：蒸气压力205.8kPa（2.1kg/cm2），温度达132℃以上并维持10分钟，即可杀死包括具有顽强抵抗力的芽胞、孢子在内的一切微生物

视频展示高压蒸汽灭菌锅的操作过程

操作方法：

1，首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架平齐。

2，放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装的太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果，锥形瓶与试管口不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包裹在瓶口的纸而透入棉塞

3，加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。拧紧固定盖子的螺栓，注意要同时旋紧相对称的两个螺栓，使螺栓松紧一致，不漏气。

4，加热灭菌锅，打开排气阀，使水沸腾，排除锅内的冷空气。等冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐步上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，按照灭菌所需要求的时间，维持压力。

5，到灭菌时间后，切断热源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表降到零时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。注意：不能提前打开排气阀，锅内压力突然下降，灭菌锅内的液体会冲出容器进入内部灭菌桶内造成灭菌物体的污染。

小结：通过本节内容的学习，我们需要进一步明确为什么要消毒，为什么要灭菌，同时要掌握不同的消毒灭菌方法具体在那些物品上使用，同时为进一步在大学微生物实验及医学实验中能够直接操作消毒灭菌的操作。

作业布置：预习培养基的配方

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