课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段获奖说课稿

专题5 DNA和蛋白质技术

课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段

【教学目标】

（一）知识与技能 1、了解PCR技术的基本操作 2、理解PCR的原理 3、讨论PCR的应用

（二）过程与方法 在多聚酶链式反应扩增DNA片段的实验过程中，应避免外源DNA污染，严格控制温度等反应条件

（三）情感、态度与价值观 通过对PCR实验的操作及结果分析，培养学生严谨的科学态度和实事求是的科研精神 【教学重点】

教学重点：PCR的原理和PCR的基本操作

【教学难点】

教学难点：PCR的原理

【教学类型】

新授课

【教学方法】讲授法、演示法

【教学过程：】

新课导入 犯罪现场图片导入，现场只剩下斑斑血迹和几缕头发丝，如何找到罪犯？

————可以通过细胞提取DNA 但是血样太少了，提取到的DNA太少，怎么办？

-------- 体外扩增DNA 如何来扩增的呢？我们一起来学习今天的内容-----多聚酶链式反应扩增DNA片段

首先我们一起回顾DNA 的组成和结构

一、PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：

1．1细胞内DNA复制条件分析：

条件

模板

原料

酶

能量

引物

组分

DNA的两条单链

四种脱氧核苷酸

解旋酶

DNA聚合酶

ATP RNA 作用

提供复制的模板

合成DNA子链的原料

打开DNA双螺旋

催化合成DNA子链

为解螺旋和合成子链供能

为DNA聚合酶提供合成的3’端起点

1．2细胞内DNA复制过程

（1）DNA的反向平行结构：

由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链，DNA双螺旋结构的反向平行结构：

（2）DNA的复制过程: 解 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

DNA聚合酶结合：

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA

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子链连接起来。

子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能够催化磷酸二酯键的形成，还具有校对功能。它在每引入一个核苷酸后都要复查一次，只有碱基配对无误后才能继续往下聚合，它不能从头合成。RNA聚合酶没有校对功能，因此RNA的合成不需要引物，而是从头合成的，它的错配可能性较大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I删去，代之以高保真的DNA链。

［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？

DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。

［思考］细胞内哪些物质是从头合成的？RNA合成、蛋白质合成。

1．3 DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。

反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。

［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）

4．PCR的反应过程

变性

复性

延伸

变性：在95℃时DNA解旋

复性：在50℃时引物与DNA单链结合

延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）

活动： 模拟循环

变性----复性———延伸

2．实验操作

2．1 PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水

2．2 实验操作步骤

2．3 按照PCR反应体系配方配制反应液；

（2）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；

（3）将微量离心管放到PCR仪中；

（4）设置PCR仪的工作参数。

（5）DNA在PCR仪中大量扩增。

2．4 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。

3．实验注意事项

3．1避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

3．2缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

3．3每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

3．4混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

4．结果分析与评价

4．1反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2．分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。

4．2将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

4．3计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数

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（三）课堂总结、点评

多DNA的复制需要酶、原料、能量、引物

PCR原理

聚DNA的变性和复性受温度影响

酶

链式

PCR过程

变性

复性

延伸

反

应

扩操作步骤

移入离心管

配制PCR反应体系

增

DNA扩增

设置工作参数

放入PCR

片

段测定含量

稀释

调零

计算

测定并读数

随堂练习

1、关于PCR技术的应用，错误的一项是 D A 古生物学、刑侦破案、DNA序列测定

B 诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学

C DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案

D 诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定

2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？

从子链的5’端向3’端延伸

3、PCR技术最突出的优点是 D A 原理简单 B 原料易找

C TaqDNA聚合酶有耐热性

D 快速、高效、灵活、易于操作

DNA

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