课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计(教案)

选修一：血红蛋白的提取和分离

【学习目标】

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

情感目标

大分子物质的提取，理解新技术的发展。

大分子物质的提取和分离对当代技术的影响。

重点难点

色谱法分离生物大分子的基本原理

【知识梳理】

一、

蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小 的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（3）分离过程：

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

1．2缓冲溶液

（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3， NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和 盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

二、实验设计

2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？ 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？

不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。

2.2选择实验材料

（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？

哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。

（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题：

血液由 和 两部分组成。血细胞中 细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是 。

2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。

洗涤红细胞的目的是什么？ 除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。

红细胞的洗涤过程为: 血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水

→缓慢搅拌10min→

1

低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

思考：加入柠檬酸钠有何目的？ 为什么要低速、短时离心？ 为什么要缓慢搅拌？

防止血液凝固； 防止白细胞沉淀； 防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。

补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血 红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎 物、脂质、甲苯有机溶剂等。

怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：

红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白

2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。

透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

在透析过程中，血红蛋白溶液中离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。

思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？

维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。

总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离（凝胶色谱操作）。

2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。

根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。

橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。

色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱

下面进行第二步――凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：

色谱柱的装填过程。

步骤

①

②

③

④

⑤

操作要求

计算称量凝胶

配制悬浮液

装填悬浮液

缓冲液洗涤平衡

操作要求

色谱柱垂直固定在支架上

根据色谱柱体积计算凝胶用量

凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀

凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

一次性缓慢倒入；轻轻敲打

立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 样品加入和洗脱。其基本过程是：

调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质

至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：

（1）红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

（2）凝胶的预处理： 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡

（3）色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。

（4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。

【例题分析】

【例1】利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（ ）

A.相对分子质量大的 B. 溶解度高的 C. 相对分子量小的 D. 所代电荷多的

【例2 】蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）

A。样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

B. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化

2

C. 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D. 样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

【例3】用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ）

A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快

C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快

【例4】凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操

作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生

物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应

用，不但应用于科学实验研究，而且，已经大规模地用于工业生产。据图回

答问题：

(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，

原因是 。(2)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是 。

(3)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体 (填“相同”或

“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是 。

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