课题3　分解纤维素的微生物的分离PPT及课堂实录内容

分解纤维素的微生物的分离

一、教学目标

1、知识与技能

（1）能简单叙述纤维素酶的种类和作用。

（2）能从土壤中分离出分解纤维素的微生物，了解这类微生物的应用。

（3）掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。

2、过程与方法

分析分离分解纤维素的微生物的实验流程，掌握实验操作的原理。

3、情感、态度与价值观

（1）通过自主设计、完成实验，培养勇于探究的科学精神。

（2）通过了解土壤中能分解纤维素的微生物在保护环境中的作用，增强社会责任感。

二、教学重难点

1．重点

从土壤中分离分解纤维素的微生物。

2．难点

从土壤中分离分解纤维素的微生物。

三、教学准备

多媒体课件。

四、课时安排

1课时。

五、教学过程

【课程导入】

上节课我们探讨学习了课题二--土壤中尿素分解菌的分离与计数，这节课我们以纤维素分解菌的分离与纯化为例，巩固加深对这方面技术的理解和掌握。糖类是生物体进行生命活动的主要能源，人类以淀粉作为能量的主要来源，但完全不能消化纤维素，二反刍动物和大量的微生物却能以纤维素作为能量的主要来源，此中奥妙何在？让我们一起来了解这种能分解纤维素的微生物。

【基础知识】

（一）纤维素和纤维素酶

1、棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。

2、纤维素酶的组成及作用：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

（二）纤维素分解菌的筛选

1、方法：刚果红染色法

2、纤维素分解菌筛选方法的原理:刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

【实验设计】

（一）分离分解纤维素的微生物的实验流程

土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落

1、土壤取样

选择纤维素丰富的环境，依赖于生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

2、选择培养

（1）目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物

（2）操作：将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。

3、梯度稀释

按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养液进行等比稀释101~107倍，之后，将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。

4、将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

（1）制备培养基：参照旁栏中的比例。

（2）倒平板操作。

（3）涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30℃倒置培养，菌落周围会出现明显的透明圈。

5、挑选产生透明圈的菌落

参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落

（二）刚果红染色法

方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应

方法二：在倒平板时就加入刚果红

方法一

缺点是操作烦琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；

优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。

方法二

优点是操作简便，不存在菌落混杂问题；

缺点一是由于培养基中还含有淀粉类物质，可以使能产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应；缺点二有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红，形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

（三）土壤中纤维素分解菌的分离实验的具体操作步骤

1、土样采集

土样采集的方法与本专题课题2类似。土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。

2、选择培养

选择培养需要的仪器有：250 mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1 mL和10 mL的移液管、天平、摇床、温度计等。

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在250 mL锥形瓶中装入30 mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。

选择培养的操作：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d，至培养基变混浊。此时可以吸取0.1 mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以按课本中所述，重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。

3、刚果红染色法分离纤维素分解菌

这一步所需要的仪器有：无菌培养皿、涂布器、1 mL移液管，装有9mL无菌水的20 mL大试管，温箱等。

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500 mL三角瓶中装入200 mL培养基，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。

倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20 mL培养基，凝固后待用。

制备菌悬液：按照本专题课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数至106。

涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1 mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30 ℃倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。刚果红染色的具体操作步骤参照课本［资料三］。

（四）课题成果评价

1、培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落：对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

2、分离的结果是否一致：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

七．板书

2.3 分解纤维素的微生物的分离

一、有关纤维素的基础知识

二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验设计

三、实验分析与评价

八、高考例题

1.（2017全国课标1）37．[生物——选修1：生物技术实践]（15分）

某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：

⑴有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生

。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是

，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是

（答出两点即可）。

⑵为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择

（填“尿素”、“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是

。

⑶用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有

_____________（答出两点即可）。

2.（2016全国课标1）39．（15分）空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：

①配制培养基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）；

②制作无菌平板；

③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；

④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。

回答下列问题：

（1）该培养基中微生物所需的氮来源于

，成分X通常是

。

（2）步骤③中，实验组的操作是

。

3.（2015全国1）39. [生物——选修1：生物技术实践]（15分）

已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：

（1）显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用于

染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用

（填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”）从菌体中提取。

（2）为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以

为碳源的固体培养基进行培养。

（3）若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用

直接计数；若要测定其活菌数量，可选用

法进行计数。

（4）为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35℃、40℃、45℃温度下降解10g油脂所需酶量依次为4mg、1mg、6mg，则上述三个温度中，

℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕

℃设计后续实验。