课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段新颖的课程导入教案

课

题（理）

课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段

课型

课时

讲学时间

新课

2 8月

日

班级

姓

名

【学习目标】

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

【重难点】

PCR的原理和PCR的基本操作

【复习】DNA的粗提取和鉴定

完成下列实验步骤：

【基础知识】阅读课本P58－63，完成下列空格

1．PCR原理：回忆DNA的复制过程，填写下列表格

参与的组分

解旋酶

DNA母链

DNA聚合酶

引物

在DNA复制中的作用

合成子链的原料

1

DNA的两条链是

的，通常将DNA的羟基末端称为

，而磷酸基团的末端称为

。DNA聚合酶不能

开始合成DNA，而只能

，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是

。

在DNA的复制过程中，复制的前提是

。在体外可通过控制

来实现。在

的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为

。PCR利用了DNA的

原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。由于PCR过程的温度高，导致DNA聚合酶失活，后来

的DNA聚合酶的发现和应用，大大增加了PCR的效率。

PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供：

，

，

，

，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。

2．PCR的反应过程

PCR一般要经历

循环，每次循环可以分为

、

和

三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由

延伸而成的DNA单链会与

结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能

，使这段固定长度的序列成指数扩增。

PCR的反应过程

变性

复性

延伸

变性：在 ℃时DNA解旋

复性：在 ℃时引物与DNA单链结合

延伸：在 ℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）

3．实验操作

在实验室中，做PCR通常使用

，它是一种薄壁塑料管。具体操作时，用微量移液器，按PCR反应体系的配方在

中依次加入各组分，再参照课本P62表的设置设计好PCR仪的循环程序即可。

［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？

4．操作提示

为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的

、

、

以及蒸馏水等在使用前必须进行

。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在

储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。在微量离心管中添加反应成分时，移液管上的枪头要

。

[疑难点拨] 1.PCR技术简介

2

PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛的应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面。

2．细胞内参与DNA复制的各种组成成分及其作用

①解旋酶：打开DNA双链

②DNA母链：提供DNA复制的模板

③4种脱氧核苷酸：合成子链的原料

④，DNA聚合酶：催化合成DNA子链

⑤引物：使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸（引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸）

3．DNA的合成方向

，，DNA的两条链是反向平行的，通常将DNA的羟基末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端。DNA聚，合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。当引物与DNA母链，通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的，，5端向3端延伸。

4．PCR的反应过程

PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性（当温度上升到90oC以上时，双链DNA解聚为单链）、复性（温度下降到50oC左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合）和延伸（温度上升到72oC左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链）三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异的复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列成指数扩增。

5．PCR技术与DNA的复制

PCR反应是通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR反应的实质就是DNA复制，所以有关PCR反应的题目与DNA复制的原理相同，计算方法也大体相同。例如：PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段。（230）

[典例解析]] 一个由15N标记的DNA分子，放在没有标记的环境中培养，利用PCR循环5次后标记的DNA分子总数的（

）

A

1/10

B

1/5

C

1/16

D1/25 【课堂总结】

多聚酶链式反应扩增DNAPCR原理

DNA的复制需要酶、原料、能量、引物

DNA的变性和复性受温度影响

变性

复性

延伸

移入离心管

放入PCR 计算

PCR过程

操作步骤

配制PCR反应体系

设置工作参数

调零

DNA扩增

测定含量

稀释

片段测定并读数

【达标练习】

1．DNA分子复制时，解旋的两条链中（

）

A仅一条作为复制模板

B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子

C两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子

D两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子，两条新链结合成一3

个全新的DNA分子

2.下列关于DNA复制过程的正确顺序是（

）

①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键③DNA分子在解旋酶的作用下解旋④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构

A①③④②⑤

B①④②⑤③

C①③⑤④②

D③①④②⑤

3.下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（

）

①DNA复制②RNA复制③转录④翻译⑤逆转录

A①②③④⑤

B①②③④

C①②③⑤

D①③④⑤

4.实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（

）

①酶

②游离的脱氧核苷酸

③ATP④DNA分子

⑤mRNA ⑥tRNA ⑦适宜的温度

⑧适宜的酸碱度

A①②③④⑤⑥

B②③④⑤⑥⑦

C②③④⑤⑦⑧

D①②③④⑦⑧

5.利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（

）

A

2

B

4

C

8

D

16，

6.关于DNA分子的叙述中，正确的是（

）

A .DNA的两条链是极性相同，同向平行

B.DNA的两条链是极性相同，反向平行

C.DNA的两条链中极性不同，反向平行的

D.DNA的两条链是极性不同，同向平行

7.假设PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反应物中大约有多少这样的DNA片段（

）

A

215

B

230

C

260

D

231 8.DNA的合成方向总是（

）延伸。

A从DNA分子的左端向右端

B从DNA分子的右端向左端

C从子链的5，端向3，端

D从子链的3，端向5，端

9.要使PCR反应在体外的条件下顺利地进行，需要严格的控制（

）

A 氧气的浓度

B酸碱度

C温度

D 大气的湿度

10.DNA分子经PCR反应循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（

）

A模板母链相同

B非模板母链相同

C两条模板母链相同

D两条模板母链都不相同

11.在（ ）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开

A. 10－20℃ B. 80－100℃

C. 20－30℃ D. 40－60℃

12.关于DNA的复制，下列叙述正确的是（ ）

A. DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5’端延伸DNA链

B. DNA复制不需要引物

C. 引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合

D. DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸

13. 下列有关PCR描述，不正确的是（ ）

A. 是一种酶促反应 B. 引物决定了扩增的特异性

C. 扩增对象是DNA序列 D. 扩增对象是氨基酸序列

二．非选择题（2个）

1．PCR技术是把某一DNA片段在实验条件下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用这种技术能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人类基因组计划”的研究中常用到这种技术。请结合有关知识，回答有关此技术的一些问题：

⑴PCR技术能把某一DNA片段进行扩增，依据的原理是： ⑵在实验条件下，DNA分子进行扩增，除了所要扩增的DNA片段处，还需要 、和 、 等条件。

⑶某DNA片段有160个碱基，其中有腺嘌呤35个，若让该DNA分子扩增三次（即复制三次）至少需要腺嘌呤脱氧核苷酸和鸟嘌呤脱氧核苷酸的数目分别是 和 个。

4

答案：⑴DNA分子具有双螺旋结构和DNA分子中碱基的互补配对

⑵四种脱氧核苷酸、能量、酶 ⑶245、315

引导学生讨论、回忆并回答目的①~⑨。

①防止血凝。

②加速血细胞破裂。

③溶解DNA。

④使2 mol/L的NaCl溶液稀释至0.14 mol/L，促DNA最大限度地析出。

⑤使含DNA的黏稠物被留在纱布上。

⑥使含DNA的黏稠物尽可能多地溶于溶液中。

⑦除去含DNA的滤液中的杂质。

⑧提取DNA。

⑨A：出现蓝色。B：无变化

[典例解析]] 一个由15N标记的DNA分子，放在没有标记的环境中培养，利用PCR循环5次后标记的DNA分子总数的（

）

A

1/10

B

1/5

C

1/16

D1/25 答案：C 解析：一个DNA分子利用PCR技术循环5次后产生的DNA分子数目为2n。而DNA的复制是半保留复制，其特点是：新形成的DNA双链，一条是来自亲代DNA分子的母链，另一条是新形成的子链。这样最初由15N标记的DNA分子复制后，其标记的两条链就分别进入两个子代DNA分子中，这样两个子代DNA分子被标记了。以后均是在没有标记的环境中培养，不论经过多少次复制，最初标记的两条链始终存在于两个DNA分子中，这样经过n次循环后，标记的DNA分子中2/2n,即1/2n-1。

［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？

核基质

5