课题3　血红蛋白的提取和分离公开课教案（教学设计）

血红蛋白的提取和分离教学设计

唐玉玲

一、教学目标

1、知识目标

尝试从血液中提取和分离血红蛋白溶液。

了解凝胶色谱法和电泳法等方法的基本原理。

2、能力目标 体验

血红蛋白提取和分离实验的严格要求，注意操作提示，规范严谨地展开实验，提升动手能力。

3、情感目标

形成科学的思维方式，提升生物科学素养和人文品质。

二、学情分析

血红蛋白的提取过程，同学们可以通过操作理解实验现象。然而对于凝胶色谱法和电泳法，其原理比较抽象，且由于教学器具未达到相关要求，同学们仅仅通过视频展示进行信息获取，还是存在理解上的困难。

三、教学重难点

1、重点：提取和分离血红蛋白溶液的具体操作。

凝胶色谱法和电泳法等方法的基本原理。

2、难点：凝胶色谱柱的制作，样品的加入与洗脱。

四、教学过程

1、引入新课

蛋白质是生命活动的主要承担者，具备多种功能，我们要采取什么方法获得蛋白质呢？

2、新课剖析

一、蛋白质分离的原理和方法

1．分离原理

依据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。

2．凝胶色谱法

(1)概念：也称为分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

(2)凝胶：微小的多孔球体，大多数由多糖类化合物构成，内部有许多贯穿的通道。

(3)原理：[填表] 蛋白质类型

相对分子质量较小

相对分子质量较大

3．缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，抑制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。

4．电泳

(1)概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

(2)原理：

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。

②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

④方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

二、血红蛋白提取和分离的实验操作

1．样品处理

(1)红细胞的洗涤

①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

②过程：

能否进入凝胶内部

能

不能

移动路程

较长

较短

移动速度

较慢

较快

(2)血红蛋白的释放

①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。

②过程：

a．将洗涤好的红细胞倒入烧杯中。

b．加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破。

c．加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜。

d．置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min，其作用是加速红细胞破裂。

e．红细胞破裂，释放出血红蛋白。

(3)分离血红蛋白溶液

2．粗分离——透析

(1)目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质。

(2)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的烧杯中，透析12 h。

3．纯化——凝胶色谱操作

(1)凝胶色谱柱的制作

①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端用砂纸磨平。

②柱底制作：打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

③柱顶制作：打孔→安装玻璃管。

④组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。

(2)凝胶色谱柱的装填

(3)样品的加入和洗脱

4．纯度鉴定

在鉴定的方法中，使用最多的是SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5．结果分析与评价

项目

分析

分层明显→样品处理完成

血液样品的处理

凝胶色谱柱的装填

血红蛋白的分离

放一支与凝胶柱垂直的日光灯→直接检查(加入大分子有色物质，如蓝色葡聚糖－2 000或红色葡聚糖)→色带均匀、狭窄、平整→装填成功

血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分离成功

3、课堂小结

蛋白质提取与分离的原理和方法

1．原理

根据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。

2．凝胶色谱法

凝胶色谱法又叫分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法：

蛋白质

项目

能否进入凝胶内部

运动路径

运动方式

运动路程

运动速度

洗脱次序

3.电泳

(1)原理：

相对分子质量大

相对分子质量小

不能进入

凝胶颗粒之间

垂直向下

较短

较快

先流出

能进入

凝胶颗粒内部

垂直向下和无规则扩散运动

较长

较慢

后流出

(2)常用方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定蛋白质分子量时通常使用SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳。在凝胶中加入SDS，可使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，然后与各种蛋白质形成蛋白质­SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

血红蛋白提取和分离的实验操作[填图]

4、当堂训练

1．凝胶色谱法中移动速度快的是(

) A．相对分子质量大的

B．相对分子质量小的

C．溶解度高的 D．溶解度低的

2．下列各项中，不是电泳使样品中各种分子分离的原因的是(

) A．带电性质差异 B．分子的大小

C．分子的形状 D．分子的变性温度

3．蛋白质提取和分离的一般步骤是(

) ①样品处理

②凝胶色谱操作

③粗分离

④SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳

⑤纯化

⑥纯度鉴定

A．①②③④⑤⑥ B．①③⑤⑥

C．③④⑤⑥ D．①③④⑤

4．将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度

离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是(

) A．血红蛋白、

甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层 B．甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层 C．脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层 D．甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层

5．随着人类基因组计划的进展和多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质进行研究时，首先要获得纯度较高的蛋白质。如图是某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的血红蛋白提取、分离流程图：

请回答下列有关问题：

(1)样品处理中红细胞的洗涤要用__________反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH＝7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是________________________________________________________________________。

(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是__________________________________，若要尽快达到理想的透析效果，可以________________________________________(写出一种方法)。

(3)血红蛋白的纯化是通过____________法将相对分子质量大的杂质蛋白除去。

(4)电泳利用了待分离样品中各种分子的________________________等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。

(5)

一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如图所示。由图可知携带者有________种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是_______________________________________________________________。

5、教学反思： 本节内容知识内容多，难度加大，学生会觉得不适应。学习的难度虽大，但是仍然注重考查基础知识：色谱法和电泳法的原理进行突破，这时应该放慢教学速度，使学生在课堂理解的基础上加深记忆，帮助学生慢慢过渡，逐渐适应血红蛋白这一新知识的生物学习。更多地注意理解原理。同时，在教学环节中还可以多增加提问环节，增强课堂凝聚力。