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课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、研究思路

㈠.筛选菌株

1、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

2、实例：

DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。

选择培养基：

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

（二）设置对照

设置对照的主要目的:是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

设置对照的方法：

证明培养基未被污染，用空白培养基作对照；

证明选择培养基的选择作用，用基础培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）接种等量同种菌液作对照；

思考：A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。

一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误。

方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验 结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

（三）统计菌落数目

常用方法：

稀释涂布平板法、显微镜直接计数法、过滤膜法

1、稀释涂布平板法（也叫活菌计数法、间接计数法）

原理：

成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

操作

①设置重复组，目的是增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择三个稀释度的菌液，分别取0.1ml接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布在整个平板表面，放在适宜的温度下培养计数菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，经涂布培养，计算出菌落平均数。

②为了保证结果的准确，一般选择菌落数在30—300的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。

计算公式

每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。

注意事项

①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。

②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

是因为当2个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数表示而不用活菌数来表示。

④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左

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右为最好。

思考题

1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

例：某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每克样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)多少？

2、显微镜直接计数法

（1）原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。

（2）方法：用血细胞计数板计数。

计数板是特制的载玻片，其上有特定的面积为1mm2，高为0.1mm的计数室，一个计数室又被分成25个（或16个）中格，每个中格再被分成16个（或25个）小格，每个计数室都由400个小格组成。

幻灯片11 （3）操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4~5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含的细菌数，再按计数公式求出每毫升样品中所含的细菌数。

（4）计算公式

每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数X400X10000X稀释倍数

（5）缺点：不能区分死菌与活菌；

不适于对运动细菌的计数；

需要相对高的细菌浓度；

个体小的细菌在显微镜下难以观察；

3、过滤膜法

以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。

原理：伊红—美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为大肠杆菌的代谢产物与伊红—美蓝结合，使菌落呈深紫色或黑色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。

大肠杆菌菌落特点：呈黑色或深紫色,有金属光泽

二、实验案例

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

（一）课题背景

1、尿素的利用

尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。

2、细菌利用尿素的原因及方程式

土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶

3、常见的分解尿素的微生物

芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。

（二）课题目的

①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌

（三）实验原理

在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，从而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微

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生物。

（四）实验流程

土壤取样、制备培养基、

样品稀释、取样涂布、微生物培养、观察并记录结果、细菌计数、对分离的菌种做进一步鉴定

（五）实验的具体操作步骤如下

土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

制备培养基

准备牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基，前者作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

样品稀释

将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL），充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度。

由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。

◆应在火焰旁称取土壤10g。

◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行

为什么分离不同的微生物采用不同的稀释度？

原因：不同微生物在土壤中含量不同

目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。

微生物的种类

分离土壤中所有细菌

分离土壤中的放线菌

分离土壤中的真菌

分离土壤中的尿素细菌

土壤稀释倍数

104、105、106 103、104、105 102、103、104 104、105、106、107 目标

平板上的菌落数应为30～300个，便于准确计数。

测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？

为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

取样涂布

按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。

微生物的培养与观察

培养不同微生物往往需要不同培养温度。

微生物

的种类

细

菌

霉

菌

放线菌

培养温度

30～37℃

25～28℃

25～28℃

培养时间

观察时间

1～2d ①每隔24h统计一次菌落数，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防3～4d 止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

5～7d ②仔细观察并记录菌落的（形状、大小、隆起和颜色等方面）特征。

将涂布好的培养皿放在某（如：30 ℃）温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。

观察记录

比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，并做好记录。

微生物的培养与观察

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细菌计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

对分离的菌种做进一步鉴定

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如图的颜色反应。

因为在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

三.结果分析与评价

1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。

2.提示：选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。

（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落

对照培养基在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。

（二）样品的稀释操作是否成功

如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。

（三）重复组的结果是否一致

如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。

四、操作提示

无菌操作

做好标记

规划时间

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