课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课时教案

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

考点、知识点:

筛选的原理：分离：计数

学习目标: 1、

分离微生物的原理；

2、利用选择培养基分离细菌；3、统计细菌数目的方法

重、难点：

1、分离微生物的原理；2、利用选择培养基分离细菌；3、统计细菌数目的方法

教学过程：

（一）

复习上一节的基础知识：

1.、微生物的营养；2.、培养基的制备；3、无菌操作技术；4、接种方法。

学生活动：复习微生物培养的基础知识（回忆) （二）

基础知识

１、课题背景：

尿素的利用：尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。

细菌利用尿素的原因：土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶

2、筛选菌株：（１）自然界中筛选：DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的；原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。启示：（自然界中目的菌株的筛选）寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

(2)选择培养基：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。根据该微生物的特点（包括营

养、生理、生长条件等）配制选择培养基：允许并有利于特定种类微生物生长的，抑制或阻止其它种类微生物生长在微生物学中，培养一定时间后，只有特定种类微生物菌数量上升，其它种类微生物生长繁殖受抑制,再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。

3、统计菌落数目的方法：

(1)稀释涂布平板法(也叫活菌计数法)：①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的____________，通过统计平板上的________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。②操作：第一，设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择________稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上，培养并计算出__________。第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。③计算公式：每克样品中的菌株数＝CV×M，其中C代表___________________________，V代表________________________________(mL)，M代表____________。

(2)显微镜直接计数法：①原理：此法利用特定的____________或______________，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由________个小格组成。②操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。③计数公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

(3)设置重复和对照：①设置重复：培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布________个平板，才能增强实验的说服力与准确性。②设置对照：实验中应设置对照，主要目的是________________________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如__________对照组，观察培养物中是否有杂菌污染；设置________培养基，观察选择培养基是否具有________作用。

（三）、实验设计

实验步骤：1、土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土3 cm左右，迅速取土壤并装入____________密封或事先准备好的________中。

2、制备培养基：①制备________________培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基作为________，用来判断选择培养基是否具有____________。②放宽稀释范围，如稀释倍数为103～107范围内的要分别涂布，而每个稀释度下需要______个选择培养基、________个牛肉膏蛋白胨培养基，因此需要15个选择培养基和5个牛肉膏蛋白胨培养基。③两种培养基应各有一个作为________对照，此外还需准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。

3、样品的稀释与涂布平板：参考下面的实验流程示意图，将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(锥形瓶体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有________ mL生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取______mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

说明：图中的1、2、3平板是____________，4为____________________作对照，判断选择培养基是否具筛选作用，还有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，验证培养基中是否____________。

4．将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。

5．挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含____________培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。

6．细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出____________，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。同时仔细观察所分离到的菌落，并记录菌落特征。

7．统计表格

表一

平板上的菌落数记录表

稀释倍数

103

104

105

106

107

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

1

2 3 ⋮

菌落

种类

1

表二

菌落特征记录表

……

形状

大小

2

3

⋮

注：一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，____________表现出________的菌落特征。

三、操作提示

1．取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要________。

2．应在________旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入________中，塞好棉塞。

3．在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在_ _______旁操作。

4．实验时要对________做好标记。注明________________________________________等。

5．为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当________________。

（四）、结果分析与评价

隆起程度

颜色

内容

有无杂菌污染的判断

选择培养基的筛选作用

样品的稀释操作

重复组的结果

结论分析

对照的培养皿中________菌落生长→未被杂菌污染

培养物中菌落数________→被杂菌污染

菌落形态多样，菌落数偏高→培养物中混入____________ 牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目________选择培养基的数目→选择培养基具筛选作用，已筛选出一些菌落

得到2个或2个以上菌落数目在________的平板→操作成功，能进行菌落的计数

若选取同一种土样，统计结果应________；如果结果相差太远，说明实验操作过程中出现操作失误，需要找出产生差异的原因

（五）、课题延伸

在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的________将尿素分解成了________。氨会使培养基的碱性增强，________升高。因此，我们可以通过检测培养基____________来判断该化学反应是否发生。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将________，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。