课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学实录

专题2微生物的培养与应用

《课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》教学设计

河北省广平县第一中学——焦红芳

课题目标

研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。

研究对象

土壤中能分解尿素的细菌

达到目的

（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌

课题背景

尿素[CO(NH2)2]是一种重要的农业氮肥。但是尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氮之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。

尿素最初是从人的尿液中发现的。

1828年，德国化学家维勒成功地通过无机物的化学反映合成了尿素，揭开了历史上人工合成有机物的新篇章。

一、研究思路 （一）筛选菌株

1、实例----耐高温DNA聚合酶的寻找

美国科学家布鲁克（1966年）--在美国黄石公园的一个热泉中发现耐热细菌。这说明在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

2、实验室中微生物的筛选原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用

选择培养分离

的方法，或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。

3、筛选菌株的培养基

思考：

KH2PO4 1.4g 1、该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分 NaHPO4 2.1g 别是什么物质？ MgSO4 H2O 0.2g 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：

尿素 葡萄糖 10.0g 2、此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？

能。只有产生脲酶的细菌才能利用

尿素 作为氮源而生1

尿素 1.0g 琼脂 15.0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。

4、选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

（二）、统计菌落数目：

1、活体计数法----稀释涂布平板法

稀释涂布平板法这一方法常用来统计样品中活菌

的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面

思考：

1、1个菌落 1个活菌。

生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活

2、统计的菌落数 实际活的细菌数。

菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品

3、用稀释涂布平板法一定要重复实验，一般

中大约含有多少个活菌为了保证准确，一般选择

菌落数在30--300的平板进行计数。

4、重复实验结果中小于30菌落的不用。

（1）操作方法：稀释涂布平板

→

统计菌落数。

（2）原理：1个菌落→1个活菌。

（3）统计原则

①、选 30∼300 个菌落的平板统计。

②、每个稀释度取3个平板取其平均值。

（4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此统计结果一般用菌落而不是用活菌数来表示。

每克样品中的菌株数=（C÷V）×M C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积； M:稀释倍数。

2、显微镜直接计数方法

（1）原理：此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。

（2）方法：用计数板计数。计数板是特制的载玻片，其上有特定的面积为1mm2，高为0.1mm的计数室，一个计数室又被分成25个（或16个）中格，每个中格再被分成16个（或25个）小格，每个计数室都由400个小格组成。

（3）操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4~5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含的细菌数，再按计数公式求出每毫升样品中所含的细菌数。

（4）计算公式

每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数X400X10000X稀释倍数

（5）

缺点：不能区分死菌与活菌

3、过滤膜法

以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养液基上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。

思考讨论

2 至少要涂布3个平板。

想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。

（三）设置对照

1、设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

2、对照实验是指除了

被测试

的条件外，其他条件都

相同

的实验。满足该条件的称为

对照组，未满足该条件的称为

实验

组。

菌落计数

系列稀释

涂布平板与培养

实验组：

配制土壤溶液

对照组：设置对照 ---- 同等条件下，培养空白培养基。

3、课本22-23页学生实验分析

（1）A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。

一是由于土样不同；

二是由于培养基污染或操作失误。

（2）究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。

实验方案有两种

a、一种方案：

可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

b、另一种方案：

将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

二、实验设计

（一）土壤取样

1、土壤是天然培养基 ---- 其微生物数量最大、种类最多。

2、土壤取样：

（1）取样的位置：土壤中70∼90％是细菌。在富含有机质的土壤层的3∼8cm处中分布着绝大多数的细菌。

（2）取样要求：铲去表层土。

（二）样品稀释

样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30--300之间。

（1）、测细菌数：一般用104、105、106稀释液。

（2）、测放线菌：一般用103、104、105稀释液。

（3）、测真菌数：一般用102、103、104稀释液。

原则：确保平板上的菌落数在30--300之间。

1、接种：用适当的稀释液作涂布平板

2、培养：

细 菌：30∼37℃，1∼2d；

（三）微生物的培养与观察 放线菌: 25∼28℃, 5∼7d；

霉 菌: 25∼28℃, 3∼4d。

3、观察：

3

a. 每24h统计一次菌落数目。

原因：不同种类的微生物，往往需不同的培养温度和培养时间，每隔24h统计1次菌落数目，选取菌落数目稳定时记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

b. 以“稳定菌落”为观察对象。原因：不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。

（四）鉴定 酚红鉴别培养基：鉴定分解尿素的细菌。

原理：脲酶催化尿素分解成氨→

培养基碱性增强→

酚红变红→

结论：该细菌能分解尿素。

注意：

1、在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。

2、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。 三、实验的具体操作提示

（一）、无菌操作

1、取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

2、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。

3、应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。

（二）、做好标记

1、实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

2、装系列稀释菌的试管在试管架上最好由低到高放置。

（三）、制定计划

四、结果分析与评价

1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。

2.提示：选择每个平板上长有30——300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。

注意：测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到

伊红美蓝鉴别性培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。

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