课题3　血红蛋白的提取和分离课堂实录【3】

《血红蛋白的提取和分离》教学设计

太谷二中

渠然

教学目标

（一）知识与技能

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

（二）过程与方法

体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤

（三）情感、态度与价值观

初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神

教学重难点

课题重点:凝胶色谱法的原理和方法

课题难点:样品的预处理；

教学工具:多媒体

教学过程

（一）引入新课

糖尿病患者使用的胰岛素可以是动物胰岛素，从动物体内提取，一般来自猪和牛两种动物，免疫原性高，现在实用较少；也可以是人胰岛素，使用基因工程手段，将人胰岛素基因转移到细菌或者酵母细胞中，利用发酵工艺，进行大规模的生产，最终生产的胰岛素需要提取分离

（二）进行新课



基础知识

一、蛋白质提取与分离的原理－－蛋白质的物理性质

蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

提取分离方法:凝胶色谱法 蛋白质鉴定的方法：电泳 二、凝胶色谱法 1.定义：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的一种有效方法，也称做分配色谱法。

2.凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

3.原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

4.分离过程：（图5－13）

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

三、鉴定方法—电泳

1.电泳的概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

2.原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方

向、阻力不同，导致不同

蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

3.分离类型：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳原理：加入SDS的作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

4.装置：

四、缓冲溶液

（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

（3）配制：通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液,其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性) 

实验操作

1．蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？

样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定。

2.样品处理--血红蛋白的分离

（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？

哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。

（2）请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题：

血液由血浆和血细胞两部分组成。

血细胞中红细胞数量最多，红细胞的含量最高的化合物是血红蛋白。

该化合物是由两个α－肽链和两个β一肽链构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的亚铁基团。

（3）具体处理：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白。

洗涤红细胞的目的是什么？

除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。

红细胞的洗涤过程为

血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水

→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？

加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。

补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白

2.粗分离

(1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液中，透析12 h。

(2)目的：将 相对分子质量较小

的杂质除去。

(3)原理：透析袋能使

小分子 自由进出，而将 大分子物质

保留在袋内。

思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？

维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。

总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？下一节课我们来研究蛋白质提取和分离的第三个步骤――纯化。

板书

课题3 血红蛋白的提取和分离

1．基础知识

2．实验设计

2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？

2.2样品处理

2.3粗分离-透析