课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课堂实录【2】

一、研究思路（阅读教材P21～23）

1．筛选菌株

微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长，该类培养基是选择培养基。

2．统计菌落数目

(1)统计菌落数目的常用方法：稀释涂布平板法。

(2)统计依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，能推测出样品中大约含多少活菌。

3．设置对照：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

二、实验设计（阅读教材P23～24）

操作步骤：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察。

1．土壤取样一般要铲去表层土，因为绝大多数细菌分布于距地表约

3～8_cm的土壤层。

2．样品的稀释：不同的微生物需要稀释的倍数不同，请填写下表

微生物

稀释倍数

细菌

104、105、106

放线菌

103、104、105

真菌

102、103、104

3.微生物的培养与观察

微生物的生长受温度的影响，菌落的数目和特征是观察的主要内容。

三、操作提示（阅读教材P25～26）

1．无菌操作：取土样用的小铁铲和盛土样的信封都要进行灭菌。称取土样要在火焰旁进行。稀释样品要在火焰旁操作。

2．做标记：对平板和试管进行标记，尤其进行系列稀释时要按照稀释度递增的顺序将试管排列成行。

四、课题延伸（阅读教材P26）

1．分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强。

2．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。

1

[共研探究] 1．自然界中目的菌株的筛选

如图是美国黄石国家公园的一个热泉，从耐热细菌中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶。

(1)实例：DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温(93 ℃左右)的DNA聚合酶。

(2)Taq细菌能从热泉中被筛选出来的原因：热泉温度70～80 ℃，淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的Taq细菌被筛选出来。

(3)自然界中目的菌株的筛选依据：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

2．实验室中目的菌株的筛选

(1)原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

(2)方法：利用选择培养基分离。

(3)选择培养基

①概念：允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。

②下面是本课题使用的培养基的配方，请分析：

2

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

将上述物质溶解后，用蒸

馏水定容到1 000 mL 1.4 g

2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g

a.由于加入了凝固剂琼脂，从物理性质看此培养基属于固体培养基，从功能上看属于选择培养基。

b．在该培养基的配方中，碳源是葡萄糖，氮源是尿素。

c．绝大多数微生物都能利用葡萄糖，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。以尿素为唯一氮源的培养基可以分离得到产生脲酶的微生物(即分解尿素的微生物)。

3．统计菌落数目

常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。

(1)统计菌落数目

①稀释：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

②计数：一般选择菌落数在

30～300的平板进行计数。

③统计：通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为使结果接近真实值，可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

(2)活菌数的计算方法(公式)：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，C表示：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V表示：涂布平板时所用的稀释液的体积；M表示稀释倍数。

4．设置对照

(1)设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

(2)设置对照的方法：①空白对照：不给对照组任何处理因素；②条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素；③自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行；④相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。

(3)教材P22～23提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因？

提示：方案一：其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

【拓展】

显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法

(1)原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的底面积为1 mm2高为0.1 mm的计数室，1 mm2的底面积又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由400个小格组成。

(2)操作：盖上盖玻片，将稀释的样品滴在计数板上，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。

(3)计数公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

3

(4)缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。

[总结升华] 1．选择培养基

(1)选择培养基的含义：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离出所需要的微生物。

(2)常见的选择培养基

①加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

②加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

③无氮源培养基可以分离固氮微生物。

④以石油为唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。

⑤将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。

2．用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项

(1)为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。

(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

[对点演练] 1．要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用(

) A．加入青霉素的培养基

B．固体培养基

C．液体培养基

D．加入高浓度食盐的培养基

解析：选B

将聚集的菌种逐步稀释分散到固体培养基的表面，经过培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的一定形态的菌落，即分离出某种细菌。

[共研探究] 下面是土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析：

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1．实验设计和操作提示

步骤

土壤

取样

制备

培养

基

实验操作

从酸碱度接近中性的潮湿土壤

中取样。先铲去表层土3～

8_cm，再取样，将样品装入事

先准备好的信封中

分别配制牛肉膏蛋白胨培养基

和以尿素为唯一氮源的选择培

养基

①称取10 g土样加到盛有90

mL无菌水的锥形瓶中，充分

摇匀

②吸取上清液1 mL，转移至盛

有9 mL无菌水的无菌大试管

中，按照上图流程进行样品的

稀释

③按照由103～107稀释度的顺

序分别吸取0.1 mL进行平板

涂布操作。按照浓度从低到高

的顺序涂布平板，不必更换移

液管

将涂布好的培养皿放在30～

37_℃温度下培养。随着培养时

间的延长，会有不同的菌落产

生。比较牛肉膏蛋白胨培养基

和选择培养基中菌落的数量

、形态等，并做好记录

操作提示

取样用的小铁铲和盛土样的

信封都要经过灭菌

牛肉膏蛋白胨培养基可以作为

对照，用来判断选择培养基是

否起到了选择作用

样品

的稀

释和

涂布

①应在火焰旁称取土样

②由于初次实验，对于稀释的

范围没有把握，因此选择了一

个较为宽泛的范围103～107倍

的稀释液

③实验时要对所用的平板、试

管作好标记。如培养皿要注明

培养基类型、培养时间、稀释

度、培养物等

培养

在牛肉膏蛋白胨培养基上生长

的菌落数目应明显多于选择培

养基上的数目，才说明选择培

养基有选择作用

①如果得到了2个或2个以上

菌落数目符合要求的平板，则

说明稀释操作比较成功

②如果同一稀释倍数的三个重

复的菌落数相差较大，表明实

验不精确，需要重新实验

③在菌落计数时，每隔24 h统

计一次菌落数目。选取菌落数

目稳定时的记录作为结果，以

防止因培养时间不足而导致遗

漏一些菌落

计数

当菌落数目稳定时，选取菌落

数在30～300的平板进行计

数。在同一稀释度下，至少对

3个平板进行重复计数，然后

求出平均值，并根据平板所对

应的稀释度计算出样品中细菌

的数目

2.土壤中微生物的分离与计数的重点剖析

(1)样品的稀释和涂布

①观察流程示意图(教材P23图2－7)，在样品稀释时每一次用吸管吸取土壤悬液前，都要吹吸三次后再吸取，目的：使土壤悬液中的菌种分布均匀，保证所吸取样液中的菌种均衡性，减少实验误差。

②为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？

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提示：a：土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，因此为获得不同类型的微生物就需要按不同的稀释度进行分离。

b．稀释度

微生物

稀释度

细菌

104、105、106

放线菌

103、104、105

真菌

102、103、104

c.目的：保证获得菌落数在30～300间的平板进行计数。

③判断样品稀释操作成功的依据：若得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，说明稀释操作比较成功。

(2)选择培养基

①伊红—美蓝只能显示有无大肠杆菌，不能只允许一种微生物生存而抑制或影响其他微生物的生存，所以伊红—美蓝培养基不是选择培养基。

②一种自养微生物与多种异养微生物混合在一起，如何将自养微生物选择出来？

提示：用不含有机碳源的培养基进行培养，因为自养微生物可以利用空气中的CO2而异养微生物不可以，所以能在培养基中生存的就是自养微生物。

③某地发生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制选择培养基将这类微生物选择出来？

提示：配制的选择培养基中，石油作为唯一的碳源，然后用这种培养基培养多种微生物，凡是能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物。

3．菌落特征：包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。

4．菌种的鉴定

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，由于细菌合成的脲酶分解尿素产生了氨，使培养基的碱性增强，pH上升，使指示剂变色，菌落周围变红。

[总结升华] 1．分离分解尿素的细菌的实验设计原则

(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板重新制作。

(2)设立两种对照组

①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的选择培养基同时进行培养。

②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目，进行对比得出结论。

2．分离尿素分解菌操作的注意事项

(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。

(2)样品稀释液的最佳浓度为每个平板上有30～300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍液，放线菌一般为103、104、105倍液，真菌一般为102、103、104倍液。

(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。

[对点演练] 2．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：

实验步骤：

(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

(2)选用________法接种样品。

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(3)适宜温度下培养。

结果分析：

(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是(

) A．一个平板，统计的菌落数是23 B．两个平板，统计的菌落数分别是22和26，取平均值24 C．三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26 D．四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25 (2)一同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2 mL)________。

(3)用这种方法测定大肠杆菌数量，实际活菌数量要比测得的数量________，因为________________________________________________________________________。

(4)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么？_________________________________________。

解析：实验步骤：(2)若要对大肠杆菌进行计数，常用稀释涂布平板法接种样品。

结果分析：(1)在选取样品时，应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。(2)平均菌落数每毫升样品中菌株数＝×稀释倍数即23.4÷0.2×106＝1.17×108。(3)由于菌落可稀释液体积能由1个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量比测得的数量多。(4)污染的原因可能是菌种不纯，也可能是培养基灭菌不彻底或接种过程操作不当。

答案：实验步骤：(2)稀释涂布平板

结果分析：(1)D

(2)1.17×108

(3)多

当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落

(4)不能。因为不能排除杂菌来自培养基或培养过程

1．在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出(

) A．乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌

B．固氮细菌、大肠杆菌、放线菌

C．固氮细菌、霉菌、放线菌

D．固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌

解析：选C

固氮细菌可以在无氮培养基上生长；青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，但不会抑制霉菌的生长；加入10%的酚的培养基可以抑制细菌和霉菌的生长，但不会抑制放线菌的生长。

2．用稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是(

)

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A．菌落数量最多的平板

B．菌落数量最少的平板

C．菌落数量适中的平板

D．若干个平板菌落数量的平均值

解析：选D

用稀释涂布平板法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测，根据此方法的实验过程可知，在某一稀释度下涂布的平板菌体数具有一定的偶然性，并不是绝对均匀，所以若干个平板菌落数量的平均值比较接近样品中菌株数的真实值。

3．下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是(

) A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上

C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时

D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

解析：选D

检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，A项正确；取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于不同的平板上，B项正确；接种后要将培养皿倒置，37 ℃恒温培养24～48小时，C项正确；在确定对照组无菌后，应选择菌落数在30～300的一组平板为代表进行计数，D项错误。

4．广东省是我国甘蔗生产区之一。甘蔗是一种高光效的C4植物，单位面积产量很高，种植面积日益扩大，目前已成为南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗→榨汁(蔗糖)→酵母菌发酵→蒸馏→成品(燃料酒精)。

(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：

步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。

步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意________和________，加琼脂后灭菌，制成固体平板。

步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。

步骤4：根据__________________________________，筛选出突变菌。

(2)上述步骤2、3和4的依据分别是_____________________________________。

解析：(1)要筛选耐高糖和耐酸的菌种，培养基中必须加入高浓度蔗糖和调低pH，能在选择培养基上生长的即为所需菌种。(2)步骤2是给其提供高糖或酸性的筛选环境；步骤3是为了获得单菌落；步骤4是根据能生长的菌株具有耐高糖和耐酸的特性筛选出突变菌。

答案：(1)添加高浓度蔗糖(葡萄糖)

调低pH

是否能在选择培养基上生长

(2)提供高糖和酸性的筛选环境；获得单菌落；能生长的菌落具有耐高糖和耐酸的特性

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