课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数获奖说课稿

专题2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

【课题背景】1.尿素的利用：尿素[CO(NH)]——重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为22NH3才能被植物吸收利用。

2.细菌利用尿素的原因：细菌体内含有能将尿素分解为二氧化碳和氨的酶。

【课题目标】1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。

2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。

【教学过程】

一．研究思路

（一）筛选菌株

1.实验室微生物的筛选原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 2.土壤中分解尿素的细菌的分离原理

土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过

程中起到催化作用。

①选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源

②鉴定方法：在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素

3.选择培养基

允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。加入青霉素的培养基：细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长。不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物。

【典型例题】

用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是(D)

A.未接种的选择培养基 B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基

C.接种了的选择培养基 D.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基

【变式训练】

选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培

养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细

菌，应选用的培养基分别为( B ) A.伊红美蓝培养基、含青霉素培养基 B.含青霉素培养基、含氨的无机培养基

C.含氨的无机培养基、含青霉素培养基 D.含青霉素培养基、伊红美蓝培养基

（二）统计菌落数目

1.显微镜直接计数法：

（1）原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

（2）方法：用计数板计数。[来源:学#科#网]

（3）优缺点：优点：能准确统计微生物的实际数目

缺点：不能区分死菌与活菌。

2.间接计数法(活菌计数法)：

（1)方法：稀释涂布平板法

(2)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活

菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

(3)操作：计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300 的平板进行计数。

(4)缺点：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上

观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

例

某同学在稀释倍数为10的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中菌落

数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL）（ B ）

A.2.34×10

B.2.34×1089 6C.234

D.23.4 （三）设置对照

1.目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度

2.实例：P22-P23 方案1：其他同学用与A同学一样的土样进行实验。如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案2：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受

到污染。

3.对照实验：除了被测试的以条件外，其他条件都相同的实验称为对照实验，其作用是比照实验组，

排除其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。

二．实验设计

1.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 2.制备培养基 牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，判断选择培养基是否起到选择作用。选用稀释倍数为10~10的稀

释液。每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。

3.样品稀释、取样涂布

因为土壤中各类微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行

分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。 注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为10～

10。

4.微生物的培养、观察并记录结果

将涂布好的培养皿放在30℃下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

5.细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进

行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 7337三．操作提示

（一）无菌操作

1.取土用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

2.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

3.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

（二）做好标记

注明培养基种类，培养日期，平板培养样品的稀释度。

（三）制定计划

[典例]（2016课标1卷.39）

空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：

①配置培养基（成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O）; ②制作无菌平板； ③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作； ④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。回答下列问题:

（1）该培养基中微生物所需的氮来源于_________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是_________________。

（2）步骤③中，实验组的操作是________________ _。

（3）若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了_________________现象。若将30（即36-6）个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法_______________（填“正确”或“不正确”）。

四．结果分析与评价

（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选菌落。

对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已经筛选出一些菌落。

（二）样品的稀释操作是否成功。

如果在某一稀释度下得到了2个或2个以上菌落数目在30 ～300平板，说明稀释比较成功，并能够进行菌落的计数。

（三）重复组的结果是否一致。

如果选取的是同一种土样，统计结果应该相近。如果结果相差太远，需要分析产生差异原因。

五、课题延伸

本课题对能分解尿素的细菌进行初步筛选。对分离的菌种进一步鉴定，需要借助生物化学方法。

在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强

，

PH 升高

。因此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应是否发生。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红

，

说明该细菌能够分解尿素

。

鉴别培养基：一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找到目的菌菌落的培养基。此培养基一般用于鉴定不同微生物。

伊红—美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为其代谢产物

与伊红—美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。

【典型例题】

下列有关“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验”的叙述，正确的是（

）A. 分解尿素的细菌能产生脲酶，将尿素分解产生氮气[来源学科网][来源学科网][来源学*科*网]

B. 将实验组和对照组平板倒置，25℃恒温培养24～48小时

C. 统计尿素分解菌的数目时，以菌落数在300以上的平板进行计数

D. 用尿素为唯一氮源、加有酚红指示剂的培养基培养尿素分解菌，指示剂变红

【答案】D 【变式训练】

下列关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述中，不正确的是(

) A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高压蒸汽灭菌后倒平板

B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL涂布到不同平板上培养

C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时

D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数

【答案】D 【课后练习】

1.尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时（ ）

A、葡萄糖在培养基中越多越好 B、尿素分解菌有固氮能力，故培养基中只需无机氮

C、尿素在培养基中越少越好 D、尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为化合态氮

2.下列属于菌落特征的是（ ）

①菌落的形状 ②菌落的大小 ③菌落的多少 ④隆起程度 ⑤颜色 ⑥有无荚膜

A.①②③④ B.①②④⑤ C.②③④⑥ D.①②③④⑤⑥