课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段教学设计一等奖

课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段

学习目标：

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

重点：PCR的原理和PCR的基本操作

难点：PCR的原理

Ⅰ．基础知识

PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：

1．细胞内DNA复制条件分析：

条件

模板

原料

组分

DNA的两条单链

四种脱氧核苷酸

解旋酶

酶

DNA聚合酶

能量

引物

ATP RNA 催化合成DNA子链

为解螺旋和合成子链供能

为DNA聚合酶提供合成的3’端起点

作用

提供复制的模板

合成DNA子链的原料

打开DNA双螺旋

2．细胞内DNA复制过程的解析：

解 旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合。

DNA聚合酶结合：DNA聚合酶与模板链结合，标志着单链合成开始。

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）

子链合成特点： 。

［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？

。

3． DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：在 ℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在 ℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件： 。

反应场所： （自动温度周期性调节）。

［思考］缓冲液相当细胞内的什么成分？（核基质）4．PCR的反应过程

变性

复性

延伸

变性：在 ℃时DNA解旋

复性：在 ℃时引物与DNA单链结合

延伸：在 ℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）Ⅱ．实验操作

（1）

PCR反应体系：缓冲液、

，

、

、两种RNA引物，水

（2）

实验操作步骤

①按照PCR反应体系配方配制反应液；

②将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；

③将微量离心管放到PCR仪中；

④设置PCR仪的工作参数。

⑤DNA在PCR仪中大量扩增。

2．4 水浴法：将微型离心管依次在

℃、

℃、 ℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。

3．实验注意事项

（1）避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

（2）缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

（3）每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

（4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

（三）课堂总结、点评

（五）巩固练习

1．DNA分子复制时，解旋的两条链中（

）

A仅一条作为复制模板

B两条链作为模板并复制出两个不同的DNA分子

C两条链作为模板并复制出两个相同的DNA分子

D两条链作为模板，各自合成一条子链，然后两条母链重新结合为原来的双螺旋分子，DNA的复制需要酶、原料、能量、引物

DNA的变性和复性受温度影响

变性

复性

延伸

移入离心管

放入PCR 计算

多聚酶链式反应扩增DNAPCR原理

PCR过程

操作步骤

配制PCR反应体系

设置工作参数

调零

DNA扩增

测定含量

稀释

片段测定并读数

两条新链结合成一个全新的DNA分子

2.下列关于DNA复制过程的正确顺序是（

）

①互补碱基对之间氢键断裂②互补碱基对之间形成氢键

③DNA分子在解旋酶的作用下解旋

④以解旋后的母链为模板进行碱基互补配对

⑤子链与母链盘旋成双螺旋状结构

A①③④②⑤

B①④②⑤③

C①③⑤④②

D③①④②⑤

3.下列各项过程中，遵循“碱基互补配对原则”的有（

）

①DNA复制②RNA复制③转录④翻译⑤逆转录

A①②③④⑤

B①②③④

C①②③⑤

D①③④⑤

4.实验室内模拟生物体DNA的复制必需的一组条件是（

）

①酶

②游离的脱氧核苷酸

③ATP④DNA分子

⑤mRNA ⑥tRNA ⑦适宜的温度

⑧适宜的酸碱度

A①②③④⑤⑥

B②③④⑤⑥⑦

C②③④⑤⑦⑧

D①②③④⑦⑧

5.利用PCR技术，把一个双链DNA分子当作第一代，经过3次循环，在第四代DNA分子中，有几条第一代脱氧核苷酸的长链？（

）

A

2

B

4

C

8

D

16，

6.关于DNA分子的叙述中，正确的是（

）

A .DNA的两条链是极性相同，同向平行

B.DNA的两条链是极性相同，反向平行

C.DNA的两条链中极性不同，反向平行的

D.DNA的两条链是极性不同，同向平行

7.假设PCR反应中，只有一个DNA的片段作为模板，请计算在30次循环后，反应物中大约有多少这样的DNA片段（

）

A

215

B

230

C

260

D

231 8.DNA的合成方向总是（

）延伸。

A从DNA分子的左端向右端

B从DNA分子的右端向左端

C从子链的5，端向3，端

D从子链的3，端向5，端

9.要使PCR反应在体外的条件下顺利地进行，需要严格的控制（

）

A 氧气的浓度

B酸碱度

C温度

D 大气的湿度

10.DNA分子经PCR反应循环一次后，新合成的那条子链的脱氧核苷酸的序列应与（A模板母链相同

B非模板母链相同

C两条模板母链相同

D两条模板母链都不相同

11.在（ ）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开

A. 10－20℃ B. 80－100℃ C. 20－30℃ D. 40－60℃

12.关于DNA的复制，下列叙述正确的是（ ）

A. DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5’端延伸DNA链

B. DNA复制不需要引物

C. 引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合

D. DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸

13. 下列有关PCR描述，不正确的是（ ）

A. 是一种酶促反应 B. 引物决定了扩增的特异性

C. 扩增对象是DNA序列 D. 扩增对象是氨基酸序列

）