课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计及教案分析

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

教学目标：1．明确用培养基对微生物进行选择的原理。

2．学会统计微生物数量的方法。

3．能进行实验设计与操作，并对实验结果进行分析和评价。

教学重点：1．明确用培养基对微生物进行选择的原理。

2．学会统计微生物数量的方法。

教学难点：能进行实验设计与操作，并对实验结果进行分析和评价。

教学过程：

第一课时：筛选菌株和计数

一、自主学习，完成填空。

1．筛选菌株的思路

(1)自然界中目的菌株的筛选

①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的TaqDNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选

①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

②方法：利用选择培养基分离。

a．选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。

b．实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。

2．统计菌落数目

(1)常用方法：稀释涂布平板法。



生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的①原理

一个活菌b.通过统计平板上的菌落数来推测样品中

大约含有的活菌数a.当样品的稀释度足够高时，培养基表面

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。

M：代表稀释倍数。

③注意事项

a．为了保证结果准确，一般设置三个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。

b．统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

c．设置对照：主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

(2)其他方法：利用显微镜直接计数。

二、合作探究，核心突破

[合作探讨]

探讨1：根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？

提示：可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。

探讨2：如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

提示：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上菌落数的平均值，然后按照公式进行计算。

探讨3：稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。

提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值偏大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。

[思维升华]

1．选择培养基的选择作用

(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(2)方法：

①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。

②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。

③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。

2．显微镜直接计数法

(1)原理：此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

2(2)方法：用计数板计数。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为1 mm2和高为0.1 mm的计数室，在1 mm的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的。如下图所示。

(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

(4)缺点：不能区分细菌的死活。

3．用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项

(1)为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。

(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

4．直接计数法与间接计数法的比较

微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者比较如下：

直接计数法

间接计数法

主要用具

计数依据

优点

缺点

计算

公式

显微镜、细菌计数板

菌株本身

计数方便、操作简单

死菌、活菌都计算在内

每毫升原液含菌株数＝400×1 0000×每小格平均菌株数×稀释倍数

培养基

培养基上菌落数

计数的是活菌

操作较复杂，且有一定误差

每毫升原液含菌株数＝平均菌落数所用涂布液的体积×稀释倍数

三、典例分析，巩固提升

自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：

实验步骤：

23456(1)制备稀释倍数为10、10、10、10、10的系列稀释液。

(2)选用____________法接种样品。

(3)适宜温度下培养。

结果分析：

6(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为10的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是(

) A．一个平板，统计的菌落数是23 B．两个平板，统计的菌落数分别是22和26，取平均值24 C．三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26 D．四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25 6(2)一同学在稀释倍数为10的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2 mL)________。

(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________，因为___________________________________________________________________。

(4)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么____________________________ __________________。

【解析】

实验步骤：(2)若要对大肠杆菌进行计数，常用稀释涂布平板法接种样品。

结果分析：(1)在选取样品时，应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。

平均菌落数68(2)每毫升样品中菌株数＝×稀释倍数即23.4÷0.2×10＝1.17×10。

稀释液体积(3)由于菌落可能由1个或多个细菌连在一起生长而成的，所以实际活菌数量比测得数量多。

(4)污染的原因可能是培养基灭菌不彻底或接种过程操作不当。

【答案】

实验步骤：(2)稀释涂布平板

8结果分析：(1)D (2)1.17×10

(3)多

当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察的是一个菌落 (4)不能。因为不能排除杂菌来自培养基或培养过程

四、课后练习，循序渐进

学法大视野 P88 第二课时：

实验设计和分析

一、自主学习，并完成填空。

1．实验设计

(1)养基”之称。同其他生物环境相比，土壤中的微生物，数量最大，种类最多—②土壤要求：富含有机质，pH接近中性且潮湿③取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层准备选择培养基，以尿素为唯一—氮源制备9个平板培养基①取样原因：土壤有“微生物的天然培

(2)

(3)平板上生长的菌落数目②稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30～300之间，便于计数—③稀释倍数：测定土壤中细菌的数量，一般选用10、10和10倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用10、10和10倍稀释；测定真菌的数量，一般选用10、10和10倍稀释456345234①稀释原因：样品的稀释程度直接影响

(4)分别用记号笔写上10、10、10倍的三种稀释液，然后用三支1 mL无菌吸管分别从10、—10、10倍的三管土壤稀释液中吸取0.1 mL对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀456456在上述培养基的9个平板底面，每三个一组(5)①培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间—②观察：每隔24 h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果

(6) 当菌落数目稳定时，取同一稀释度下的3个—平板进行计数，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目

2．操作提示

(1)无菌操作

①取土样的用具在使用前都需要灭菌。

②应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

(2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好标记。

(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。

3．菌种鉴定

(1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。

(2)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

二、合作探究，核心突破

[合作探讨]

探讨1：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？当测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？

提示：这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的；为确保能从中选择出菌落数在30～300之间的平板进行计数。

探讨2：在稀释涂布平板法中，为何需涂布3个平板？

提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。

探讨3：统计菌落数目的理论依据是什么？

提示：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

探讨4：为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？

提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。

[思维升华]

1．分离尿素分解菌操作中的注意事项

(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。

45(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30～300个菌落，细菌一般为10、10、634523410倍的稀释液，放线菌一般为10、10、10倍的稀释液，真菌一般为10、10、10倍的稀释液。

(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。

(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板重新制作。

(5)注意培养时间和温度，获取准确的菌落数。细菌：30～37 ℃，培养1～2 d；放线菌：25～28 ℃，培养5～7 d；霉菌(真菌)：一般在25～28 ℃，培养3～4 d。

(6)微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。仔细观察分离到的菌落，记录它们的特征。

(7)做好标记

本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就做好标记。

(8)规划时间

对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。

2．结果分析与评价

内容

结果分析

有无杂菌污染的判断

对照的培养皿中无菌落生长―→未被杂菌污染

培养基中菌落数偏高―→被杂菌污染

菌落形态多样，菌落数偏高―→培养物中混入其他杂菌

选择培养基的筛选作用

牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目大于选择培养基的数目―→选择培养基具有筛选作用

得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板―→操作成功

若选取同一种土样，统计结果应接近

三、典例分析，巩固提升

饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以吸收利用的磷酸盐等。下图是学生们从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株的过程。

样品的稀释操作

重复组的结果

(1)分离产植酸酶的菌株，需先配制合适的培养基。配制培养基时，在各成分都溶化后和分装前，要进行的是__________和灭菌。对培养基进行灭菌的常用方法是____________。倒平板时，一般需冷却至50 ℃左右，在酒精灯火焰附近操作。据物理性质，该培养基属于________培养基。依功能看，该培养基属于________培养基。

(2)接种以前进行的一系列稀释操作，目的是在培养皿表面形成________，这种接种方法是____________。根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数就能大致推测出样品中的活菌数。如果一培养基上有3个菌落，则1 g土壤中大致的活菌数量是________个。

(3)由于植酸钙的不溶解性，可使培养基形成白色浑浊。产植酸酶的菌株会水解植酸钙，菌落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断该菌是否产植酸酶。实验结果显示A～E五种菌株中，________是产植酸酶的理想菌株。

【解析】

(1)配制培养基时，在各成分都溶化后和分装前，要进行的是调整pH和灭菌；对培养基灭菌的常用方法是高压蒸汽灭菌法；根据题意，进行了倒平板操作，据物理性质，该培养基属于固体培养基，该培养基用于分离产植酸酶的菌株，依功能看，该培养基属于选择培养基。(2)接种前进行的一系列稀释操作，目的是在培养皿表面形成单个菌落，这种接种方法是稀释涂布平板法；

根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积可以计算出，如果一培养基上有3个菌落，56则土壤中大致的活菌数量是3÷0.1×10＝3×10(个)。(3)根据原理可知，A～E五种菌株中，E的透明圈最明显，所以E是产植酸酶的理想菌株。

【答案】(1)调整pH 高压蒸汽灭菌法 固体

选择

6(2)单个菌落 稀释涂布平板法

3×10

(3)E 四、课后练习，循序渐进

学法大视野 P89