课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀完整教案

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

【学习目标】

1．明确用培养基对微生物进行选择的原理。(重点) 2．学会统计微生物数量的方法。(重点) 3．能进行实验设计与操作，并对实验结果进行分析和评价。(难点) 【学习过程】

【菌

株

的

筛

选

及

统

计

菌

落

数

目

的

方

法】

1．筛选菌株的思路

(1)自然界中目的菌株的筛选

①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的TaqDNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选

①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

②方法：利用选择培养基分离。

a．选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。

b．实例：选择分解尿素的细菌的培养基，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。

2．统计菌落数目

(1)常用方法：稀释涂布平板法。

b.通过统计平板上的菌落数来推测样品中①原理

大约含有的活菌数

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。 V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。 M：代表稀释倍数。

③注意事项

a．为了保证结果准确，一般设置三个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。

b．统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。

c．设置对照：主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

(2)其他方法：利用显微镜直接计数。

核心突破

探讨1：根据选择培养基的原理，如何筛选出耐酸菌？

可将培养基的pH调至酸性，再接种培养。

探讨2：如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上菌落数的平均值，然后按照公式进行计算。

探讨3：稀释涂布平板法和显微计数法对微生物计数产生的实验误差如何？试分析原因。

稀释涂布平板法计数的值比实际值偏小，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；显微计数法计数的结果比实际值偏大，原因是显微镜下无法区分细胞的死活，计数时包括了死细胞。

1．选择培养基的选择作用

(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(2)方法：

①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。

②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。

1

③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。

2．显微镜直接计数法

(1)原理：此法利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

(2)方法：用计数板计数。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积为1 mm2和高为0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的。如下图所示。

(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

(4)缺点：不能区分细菌的死活。

3．用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项

(1)为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。

(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

4．直接计数法与间接计数法的比较

微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者比较如下：

直接计数法

间接计数法

主要用具

显微镜、细菌计数板

培养基

计数依据

菌株本身

培养基上菌落数

优点

计数方便、操作简单

计数的是活菌

缺点

死菌、活菌都计算在内

操作较复杂，且有一定误差

每毫升原液含菌株数＝(C/V)xM=计算

每毫升原液含菌株数＝400×10000平均菌落数公式

×每小格平均菌株数×稀释倍数

所用涂布液的体积(mL）×稀释倍数

【实

验

设

计

及

操

作

提

示】

1．实验设计

（1）土壤取样：—取样部位：距地表约3-8cm的土壤层且潮湿

（2）

制备培养基：准备选择培养基，以尿素为唯一氮源制备9个平板培养基

45234（3）

样品稀释：10和10倍稀释；测定真菌的数量一般选用1010和10倍稀释；

（4）

涂布平板：对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌涂布器在培养基表面轻轻地涂布均匀

（5）培养与观察：每隔24h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果

（6）计数：平板进行计数，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目

2．操作提示

(1)无菌操作

①取土样的用具在使用前都需要灭菌。

②应在火焰旁称取土壤，并在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

③在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

2

(2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好使用前就做好标记。

(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。

3．菌种鉴定

(1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。

(2)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

核心突破

探讨1：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？当测定时为什么要将稀释的范围放宽一些？

这是因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的；为确保能从中选择出菌落数在30～300之间的平板进行计数。

探讨2：在稀释涂布平板法中，为何需涂布3个平板？

作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。

探讨3：统计菌落数目的理论依据是什么？

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

探讨4：为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？

尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌体开始看不出明显的菌落。

1．分离尿素分解菌操作中的注意事项

(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。

(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30～300个菌落，细菌一般为104、105、106倍的稀释液，放线菌一般为103、104、105倍的稀释液，真菌一般为102、103、104倍的稀释液。

(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。

(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板重新制作。

(5)注意培养时间和温度，获取准确的菌落数。细菌：30～37 ℃，培养1～2 d；放线菌：25～28 ℃，培养5～7 d；霉菌(真菌)：一般在25～28 ℃，培养3～4 d。

(6)微生物的菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等方面。仔细观察分离到的菌落，记录它们的特征。

(7)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，最好在使用前就做好标记。

(8)规划时间

对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊。

2．结果分析与评价

内容

有无杂菌污染的判断

选择培养基的筛选作用

样品的稀释操作

重复组的结果

结果分析

对照的培养皿中无菌落生长―→未被杂菌污染

培养基中菌落数偏高―→被杂菌污染

菌落形态多样，菌落数偏高―→培养物中混入其他杂菌

牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目大于选择培养基的数目―→选择培养基具有筛选作用

得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板―→操作成功

若选取同一种土样，统计结果应接近

课堂小结：

1.网络构建

2.核心回扣

（1）选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，

同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。

（2）设置对照的主要目的是排除实验中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

（3）不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

（4）在标记培养皿时，应注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。

3

（5）为确保结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板上进行计数。

（6）只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。

（7）鉴定分解尿素细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，根据是否变红进行判断。

【巩固练习】

1．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：

实验步骤：

(1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

(2)选用____________法接种样品。

(3)适宜温度下培养。

结果分析：

(1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是( ) A．一个平板，统计的菌落数是23

B．两个平板，统计的菌落数分别是22和26，取平均值24 C．三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26 D．四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25 (2)一同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2 mL)________。

(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量要比测得的数量________，因为________________。

(4)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么______________________________________________。

(2)稀释涂布平板

结果分析：(1)D

(2)1.17×108

(3)多

当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察的是一个菌落

(4)不能。因为不能排除杂菌来自培养基或培养过程

2．饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以吸收利用的磷酸盐等。下图是学生们从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株的过程。

(1)分离产植酸酶的菌株，需先配制合适的培养基。配制培养基时，在各成分都溶化后和分装前，要进行的是__________和灭菌。对培养基进行灭菌的常用方法是____________。倒平板时，一般需冷却至50 ℃左右，在酒精灯火焰附近操作。据物理性质，该培养基属于________培养基。依功能看，该培养基属于________培养基。

(2)接种以前进行的一系列稀释操作，目的是在培养皿表面形成________，这种接种方法是____________。根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数就能大致推测出样品中的活菌数。如果一培养基上有3个菌落，则1 g土壤中大致的活菌数量是________个。

(3)由于植酸钙的不溶解性，可使培养基形成白色浑浊。产植酸酶的菌株会水解植酸钙，菌落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断该菌是否产植酸酶。实验结果显示A～E五种菌株中，________是产植酸酶的理想菌株。

【解析】

(1)配制培养基时，在各成分都溶化后和分装前，要进行的是调整pH和灭菌；对培养基灭菌的常用方法是高压蒸汽灭菌法；根据题意，进行了倒平板操作，据物理性质，该培养基属于固体培养基，该培养基用于分离产植酸酶的菌株，依功能看，该培养基属于选择培养基。(2)接种前进行的一系列稀释操作，目的是在培养皿表面形成单个菌落，这种接种方法是稀释涂布平板法；

根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积可以计算出，如果一培养基上有3个菌落，则土壤中大致的活菌数量是3÷0.1×105＝3×106(个)。(3)根据原理可知，A～E五种菌株中，E的透明圈最明显，所以E是产植酸酶的理想菌株。

【答案】

(1)调整pH

高压蒸汽灭菌法

固体

选择

(2)单个菌落

稀释涂布平板法

3×106

(3)E

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