复习与测试优质课教案设计

课

题

教

学

目

标

专题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

教方学法

讲述与学生练习、讨论相结合

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数

教

材

分

重点

难点

对土样的选取和选择培养基的配制

对分解尿素的细菌的计数

教案

教具

析

教

一、培养基与无菌技术

1.

培养基：

（1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养物质。

（2）营养构成：水、无机盐、碳源、氮源和生长因子。

碳源：有机碳源：葡糖糖、淀粉等（利用有机碳源为异养型）

无机碳源：二氧化碳、碳酸氢钠等（利用无机碳源为自养型）

氮源：有机氮源：牛肉膏、蛋白胨（主要为微生物提供糖、维生素和有机氮等营养物质）

无机氮源：氮气（蓝藻）、氨气（硝化细菌）、铵根、硝酸根（植物）

生长因子：某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。（培养基的其他成分可能含有，不一定要额外加）。

例：培养乳酸杆菌时需要添加

维生素，培养霉菌时需要将培养基pH调节为

酸性

，培养细菌时需要将pH调节为

中性或微碱性。

拓展：根据代谢方式分类

学

过

程

（3）制备步骤：计算--称量--溶化--灭菌--倒平板。

注意事项：倒平板要在50摄氏度（手可以接受的温度）。

（4）类型：根据物理性质可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；根据功能可分为选择培养基和鉴别培养基。

划分标准

物

理

性

质

化

学

成

分

在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的培养、分离出特定微生合成培养基

固体培养基

培养基种类

液体培养基

半固体培养基

特点

不加凝固剂

加凝固剂，如琼脂

用途

工业生产

观察微生物的运动、分类鉴定

微生物的分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种

含化学成分不明确的天然物质

培养基成分明确

工业生产（例蘑菇生产）

天然培养基

分类、鉴别

用

途

选择培养基

微生物的生长，促进所需要的微生物的生长

在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用以鉴别不同种类的微生物

物

鉴别不同种类微生物

鉴别培养基

2.选择培养基和鉴别培养基的应用实例

1.尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为

氨和CO2

，这是因为细菌能合成

脲酶

。

2.科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为

热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物

，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长

。

点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。

在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是

葡萄糖

，提供氮源的的是

尿素

，琼脂的作用是

凝固剂

。

该培养基对微生物

具有

（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是

只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长

。

类型

选择

培养基

实例

培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌（抗生素可以抑制肽聚糖的合成，而不能抑制几丁质的合成）

培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄糖球菌

以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌

不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物

石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。

培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物

鉴别

培养基

伊红--美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌（菌落呈深紫色并带金属光泽）

3.无菌培养

目的：防止外来杂菌的入侵。

无菌技术包括：

（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；

（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；

（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；

（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。

方法：(日常生活经常用到的是煮沸消毒法) 类型

方法

巴氏消毒

对象

牛奶等不耐高温液体

接种室、接种箱或超净工作台

操作者双手

接种针（环）

玻璃器皿（如培养皿）和金属用具等

培养基

比较消毒和灭菌

比较项

理化因素的作用强度

消毒

灭菌

较为温和

强烈

消灭微生物的数量

部分生活状态的微生物

全部微生物

芽孢和孢子能否被消灭

不能

能

消毒

紫外线（杀死蛋白和DNA）

化学药剂（如酒精）

灼烧灭菌

灭菌

干热灭菌

高压蒸汽灭菌

注意事项：（1）无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是防止感染实验操作者。

（2）对接种环灭菌时要用酒精灯的充分燃烧层火焰灼烧可能伸入试管或培养皿的部位。

（3）利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是避免妨碍热空气流通。

（3）物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是有利于锅内温度升高；随后关闭排气阀继续加热，气压升至

100k Pa，温度为121℃，并维持15～30 min；最后切断热源，使温度自然降温，气压务必降至零时打开锅盖，其目的是防止容器中的液体暴沸。

（4）化学药剂的消毒方法，其作用原理使细菌体内蛋白质变性，但是化学物质很难透过芽孢或孢子的坚硬外层进入细胞内，因此化学药剂消毒方法难以消灭孢子和芽孢。

（5）体积百分之70%的乙醇杀菌效果最强，浓度过低，杀菌力弱，浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固形成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其内，因此杀菌效果受影响。

二、纯化大肠杆菌的无菌操作和菌种保存

1.大肠杆菌：

（1）特性：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌

（2）用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具

2.牛肉膏蛋白胨固体培养基：

培养基的配制原则：

①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。

②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如：碳氮比4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。

③pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。

实验操作：

2．1 计算：根据配方比例，计算100mL培养基各成分用量。

2．2 称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空气中水分。

2．3 溶化：①加水加热熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化钠继续加热；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。

2．4 调pH：用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性。

2．5 灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。

2．6 倒平板：待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。

其过程是：

①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；

②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；

③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。

④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置（防止水分倒流污染培养皿）。

〖思考1〗锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基。

〖思考2〗倒平板的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。

〖思考3〗若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？

不能。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。

〖思考4〗配制斜面培养基中，试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。

〖思考5〗试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。

3.纯化大肠杆菌

2．7 接种

2．7．1微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法，另外还有穿刺接种和斜面接种等。

2．7．2平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。其操作步骤是：

①将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。

②在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。

③将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。

④将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。

⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。

⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划3～5条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。

⑦灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。

⑧将平板倒置放在培养箱中培养。

〖思考6〗取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。

〖思考7〗在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。

2．7．3

稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。

2．7．4

系列稀释操作：

①取盛有9mL水的无菌试管6支，编号101、102、103、104、105、106。

②用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次，使之混匀。

③从101倍液中吸取1mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。

〖思考8〗操作中试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。整个操作过程中使用了1支移液管。

3．1

培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。

3．2

在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。

3．3

培养12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。

〖思考9〗在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。

〖思考10〗频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，长期保存菌种的方法是甘油管藏法。前者利用固体斜面培养基培养后，保存在4℃冰箱中，每3～6个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，容易发生污染和变异；后者将菌种与无菌体积等量混合后保存在－20℃冷冻箱中。

练习：

例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是

A.是碳源的物质不可能同时是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外的无机物只提供无机盐

D.无机氮源也能提供能量

解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源

可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHC O3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。

答案：D

例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是

A.防止杂菌污染

B.消灭杂菌

C.培养基和发酵设备都必须灭菌

D.灭菌必须在接种前

解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。

答案：B

课堂总结、点评

例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：

（1）右表培养基可培养的微生物类型是

。

（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入

，用于培养

。

（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养

。

（4）表中营养成分共有

类。

（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是

。

（6）右表中各成分重量确定的原则是

。

编号

①

②

③

④

⑤

⑥

⑦

成分

粉状硫

（NH4）2SO4

K2HPO4

MgSO4

FeSO4

CaCl2

H2O 含量

10g 0.4g 4.0g 9.25g 0.5g 0.5g 100ml （7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是

。

解析：对于一个培养基，它能培养何种微生物，要看它的化学成分。当然这只适用于合成培养基，如果是一个天然培养基就不能从培养基的成分上区分它是培养何种微生物的。分析化学成分要从营养物质的类型出发。右表中的营养物质有水、无机盐、氮源三类，缺乏碳源和特殊营养物质。对特殊营养物质，有的微生物是不需要的，但没有微生物是不需要碳源的。该培养基中没有碳源，说明培养的微生物是从空气中获得碳源的，即可培养的微生物就是自养型微生物了。该培养基中加入了过量食盐，就可以成为金黄色葡萄球菌鉴别培养基，但金黄色葡萄球菌是异养型微生物，这个培养基就还需要加入有机碳源。该培养基若加入（CH2O），培养基中就有了碳源，但除去成分②，却使培养基中没有了氮源，这时就只能用于培养固氮微生物了。对于菌种鉴定，往往用的是固体培养基，而表中没有凝固剂，需要加入常见的凝固剂——琼脂。

答案：

⑴自养型微生物

⑵含碳有机物

金黄色葡萄球菌

⑶固氮微生物

⑷3

⑸调整pH

⑹依微生物的生长需要确定

⑺琼脂（或凝固剂）

【巩固练习】

1．不可能作为异养微生物碳源的是

A．牛肉膏

B．含碳有机物

C．石油

D．含碳无机物

2．根瘤菌能利用的营养物质的组别是

A．NH3，（CH2O），NaCl

B．N2，（CH2O），CaCl2

C．铵盐，CO2，NaCl

D．NO2，CO2，CaCl2

3．配制培养基的叙述中正确的是

A．制作固体培养基必须加入琼脂

B．加入青霉素可得到放线菌

C．培养自生固氮菌不需氮源

D．发酵工程一般用半固体培养基

4．自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是

A．碳源

B．氮源

C．无机盐

D．特殊营养物质

5．下表是有关4种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的概述。其中正确的是(

)

生

物

硝化细菌

能

源

碳

源

氮

源

氧化NH3

C02

NH3 根瘤菌

酵母菌

谷氨酸棒状杆菌

光

能

糖类

尿

素

自养需氧型

N2的固定

分解糖类等有机物

糖类

N2

糖类

NH4+、NO3-

异养兼性厌氧型

代谢类型

自养需氧型

异养需氧型

A．根瘤菌、谷氨酸棒状杆菌

B．硝化细菌、酵母菌

C．酵母菌、谷氨酸棒状杆菌

D．硝化细菌、根瘤菌

6．微生物（除病毒外）需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。下列有关微生物营养的说法正确的是

A．乳酸菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的

B．微生物生长中不可缺少的一些微量的无机物称为生长因子

C．培养基中的营养物质浓度越高对微生物的增殖越有利

D．生长因子一般是酶或核酸的组成成分，微生物本身合成这些生长因子的能力往往不足。

7．要将从土壤中提取的自生固氮菌与其他的细菌分离出来，应将它们接种在

A．加入氮源和杀菌剂的培养基上

B．不加入氮源和不加杀菌剂的培养基上

C．加入氮源，不加杀菌剂的培养基上

D．不含氮源和杀菌剂的培养基上

8．甲、乙、丙是三种微生物，下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ种正常生长繁殖；甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能下列说法正确的是

（

）

粉状硫

10g Ⅰ

+ K2HPO4

4g + FeSO4

0.5g + 蔗糖

10g + （NH4）2SO4

0.4g - H2O 100ml + MgSO4

9.25g + CaCl2

0.5g +

Ⅱ

Ⅲ

+ + + + + + - + + + + + + + + + A、甲、乙、丙都是异养微生物

B、甲、乙、丙都是自养微生物、丙是异养微生物

C、甲是固氮微生物、乙是自养微生物、丙是异养微生物

D、甲是异养微生物、乙是固氮微生物、丙是自养微生物

9．某一种细菌株要从环境中提取现成的亮氨酸（20种氨基酸中的一种）才能生长，此菌株对链霉素敏感。实验者用诱变剂处理此菌株，想筛选出表中细菌菌株类型。根据实验年目的，选用的培养基类型是（

）

注：Ｌ—亮氨酸

Ｓ—链霉素

“＋”—加入

“—”—不加入

如：Ｌ—：不加亮氨酸

Ｓ＋：加入链霉素

选项

筛选出不需要

亮氨酸的菌株

Ａ

Ｂ

Ｃ

Ｄ

10．酵母菌培养液中常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡萄糖浓度过高时，反而抑制微生物的生长，原因是

A．碳源供应太充足

B．细胞会发生质壁分离

C．改变了酵母菌的pH值

D．葡萄糖不是酵母菌的原料

答案：DACAC

CDBBB 资料——微生物的特点

1.个体微小，结构简单

在形态上，个体微小，肉眼看不见，需用显微镜观察，细胞大小以微米和纳米计量。

2.繁殖快

生长繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代。

3.代谢类型多，活性强。

4.分布广泛

有高等生物的地方均有微生物生活，动植物不能生活的极端环境也有微生物存在。

Ｌ＋

Ｓ＋

Ｌ－

Ｓ—

Ｌ—

Ｓ＋

Ｌ＋

Ｓ—

筛选出

抗链霉素的菌株

Ｌ—

Ｓ—

Ｌ＋

Ｓ＋

Ｌ＋

Ｓ＋

ｌ—

Ｓ—

筛选出不需要亮氨酸的

抗链霉素的菌株

Ｌ＋

Ｓ－

Ｌ—

Ｓ＋

Ｌ—

Ｓ—

Ｌ＋

Ｓ＋

5.数量多

在局部环境中数量众多，如每克土壤含微生物几千万至几亿个。

6.易变异

相对于高等生物而言，较容易发生变异。在所有生物类群中，已知微生物种类的数量仅次于被子植物和昆虫。微生物种内的遗传多样性非常丰富。所以微生物是很好的研究对象，具有广泛的用途。

三、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1．基础知识

1．1 尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为

氨和CO2

，这是因为细菌能合成

脲酶

。

1．2 科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为

热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物

，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长

。

点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。

实验：

两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230. 第二位同学在该浓度下徒步了三个平板，统计的菌落数分别为21、212和256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。

〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是

葡萄糖

，提供氮源的的是

尿素

，琼脂的作用是

凝固剂

。

〖思考2〗该培养基对微生物

具有

（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是

只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长

。

1.3在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。除此之外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。

【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。

公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量

1.4采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于

样品稀释液中一个活菌

。通过统计

平板上的菌落数

，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在

30～300 的平板进行计数。

〖思考3〗从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是

（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数

。

〖思考4〗利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是

恰当的稀释度

。

1.5统计的菌落数比活菌的实际数目

低

。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是

一个

菌落。因此，统计结果一般用

菌落数

来表示。

1.6设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足该条件的称为对照组，未满足该条件的称为实验组。

〖思考6〗请设计本实验的对照实验组：

A同学从对应的106的培养基中筛选出大约150个菌落。但是，其他同学在同样的稀释度下只选择出大学50个菌落。

其他同学认为A同学的结果有问题。他们分析可能是A同学的培养基被杂菌污染了，或者培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿素的细菌也能在该培养基上生长。

但是，A同学确信自己的实验操作准确无误，与其他同学结果之所以不同，是因为自己所做的土壤样品不同。但是，A同学在设计实验的时候并没有设置对照，因而此时也拿不出令同学们信服的证据。

你能通过设置对照组，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素吗？

方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。

2．实验设计

2．1 实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。

2．2 根据图示2－7填写以下实验流程：

2．3 土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～80％为细菌。

2．4 分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为104、105、106，放线菌稀释度为103、104、105，真菌稀释度为102、103、104。

2．5 培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在30～37℃培养1～2d，放线菌一般在25～28℃培养5～7d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。

2．6 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

点评：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌

体都能形成肉眼可观察到的菌落。

2．7菌落的特征包括

形状、大小、隆起程度、颜色

等方面。

〖思考8〗土壤微生物种类最多、数量最大的原因是什么？

土壤中营养物质含量丰富，环境条件适宜等。

2．8 实验过程

1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

2）应在火焰旁称取土壤

10 g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。

3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。

4）实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。

〖思考9〗在研究未知微生物时务必规范操作，以防被致病微生物感染，实验后一定要洗手。

3．结果分析与评价

3．1

对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助

生物化学

的方法。

3．2在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的

脲酶

将尿素分解成了

氨

。氨会使培养基的碱性

增强

，PH

升高

。因此，我们可以通过检测培养基

pH 变化来判断该化学反应是否发生。

3．3

在以

尿素

为唯一氮源的培养基中加入

酚红

指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变

红

，说明该细菌能够

分解尿素

。

〖思考10〗测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到

伊红美蓝

培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现

黑

色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取

三

个水样。

课堂总结、点评

实例探究

例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是

A．在液体培养基上进行

B．至少接种一种细菌

C．接种一个细菌

D．及时补充消耗的营养物质

解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。

答案：A

例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是

A．调整期

B．对数期

C．稳定期

D．衰亡期

解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。

答案：C

例3．（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。

⑴青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是

，青霉素是青霉菌的

代谢产物。

⑵在生产和科研中，常选用处于

期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，

和

比较稳定。

⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，

，再计算发酵罐中菌体的总重量。

解析：青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型，而青霉素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。在测定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法有两种：一种是测量青霉菌的细胞数目，另一种是测重量，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。在细菌生长的四个主要时期中，因为处于对数期的细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和科研的材料。

答案：⑴异养需氧型

次级

⑵对数

个体的形态生理特性

⑶称菌体的湿重（称烘干后的重量）

【巩固练习】

1．在一个“淀粉—琼脂”培养基的5个圆点位置，分别用不同方法处理，将此实验装置放在37℃恒温箱中，保温处理24h后，将碘液滴在培养基的5个圆点上，其实验结

果记录于下表：（C）

淀粉圆点

①

②

③

④

⑤

实验处理方法

新鲜唾液与盐酸混合

经过煮沸的新鲜唾液

接种面包霉

只有新鲜的唾液

只有一定浓度的蔗糖溶液

碘液处理后的颜色反应

蓝黑色

蓝黑色

棕黄色

？

？

请指出④和⑤所发生的颜色反应，以及③接种的面包霉的分泌物分别是（

）

A．棕黄色、棕黄色、淀粉酶

C．棕黄色、蓝黑色、淀粉酶

B.蓝黑色、棕黄色、麦芽糖酶

D.棕黄色、蓝黑色、麦芽糖酶

2．实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析以下叙述，不正确的是

A．链霉素能阻止结核菌的生长

B．链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效

C．链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效

D．链霉素可以用于治疗伤寒病人

3.利用生物工程生产啤酒、味精、胰岛素、酸奶的常用菌种分别是（

）

A．酵母菌、枯草杆菌、大肠杆菌、乳酸菌

B．酵母菌、大肠杆菌、青霉菌、乳酸菌

C．酵母菌、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、乳酸菌

D．黄色短杆菌、酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌

4．下列操作不属于微生物的分离步骤的是（

）

A．

稀释

B．划线或涂布

C．接斜面

D．培养

5．影响微生物生长的主要环境因素是（

）

A．阳光、温度、水分

B．温度、水分、PH

C．水分、PH、氧

D．温度、PH、氧

6.下列微生物的产物中没有菌种特异性的一组是（

）

A．氨基酸、核苷酸、多糖、色素

B. 多糖、脂类、维生素、抗生素、氨基酸

C．核苷酸、多糖、维生素、毒素、抗生素

D．核苷酸、维生素、多糖、脂类、氨基酸

7．微生物代谢的人工控制是指（

）

A.改变微生物的遗传特性

B.控制发酵时的温度

C.调节发酵过程中的pH，氧气通入量

D.包括A、B、C三项

8．在微生物群体生长规律的测定中，不可能发生的是（

）

A.繁殖

B.生存斗争

C.种间斗争

D.种内斗争

9．与调整期长短有关的因素中，可缩短调整期的一组是（

）

①用与菌种相同的培养基

②营养丰富的培养基

③稳定期获得的菌种

④对数期获得的菌种

⑤接种时间提前

⑥接种量加大

⑦接种量减小

⑧接种种类加大

A、①③⑤⑦

B、②③⑤⑦

C、①④⑥

D、②④⑤⑥⑧

10．微生物群体生长善的测定方法可以是（

）

①测定样品的细胞数目

②测定次级代谢产物的总产量

③测定培养基中细菌的体积

④测定样品的细胞重量

⑤测定初级代谢产物的总产量

A.②④

B.①④

C.①③⑤

D.②③④

答案：1—5 CDCCD

6—10 DDCCB 四、分解纤维素的微生物的分离

1．基础知识

活动1：阅读“纤维素与纤维素酶”，回答下列问题：

1．1纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。

延伸：草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？因为肠胃中的共生物生物。

1．2棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素的分解需要在纤维素酶的催化作用下完成，请完成下列过程：

〖思考1〗实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？

在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸－醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的pH。

〖思考2〗1个酶活力单位是指在温度为

25 ℃，其它反应条件最适宜情况下，在

1 min内转化

1mmol 的底物所需要的酶量。

活动2：阅读“纤维素分解菌的筛选”，回答下列问题：

即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌

1．3筛选纤维素分解菌的方法是刚果红染色法。该方法可以通过颜色反应直接筛选。

2．4其原理是：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

四种纤维素分解菌在刚果红培养基上形成的透明圈

2．实验设计

活动3：完成实验方案流程图，讨论回答问题：

〖思考3〗实验流程中“选择培养”的培养基类型是什么？该培养的目的是什么？

答：液体选择培养基。其目的是使纤维素分解菌增殖，含量增多。

〖思考4〗本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同？

答：尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上；本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布在鉴别培养基上。其它操作基本基本共同。

活动4：阅读资料一“土壤取样”，回答下列问题：

根据经验，纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，因此，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶，等等。你还可以将富含纤维素的物质，如滤纸等，埋在土壤里。经过30d左右，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。

2．1纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中。

2．2为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

答：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用，只有在纤维素含量丰富的环境中纤维素分解菌的含量才会高于其它普通环境，从而提高获得目的微生物的几率。

2．3将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？

答：人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。

活动5：阅读资料二“选择培养基”，回答以下三个问题：

在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，可以通过选择培养基增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需的微生物。请分析旁栏中的培养积极配方，回答下面的问题。

1.旁栏的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？

答：纤维素分解菌选择培养基属于液体培养基，原因是没有添加琼脂成分。

2.这个培养基对微生物是否具有选择性作用？如果具有，又是如何进行选择的？

答：培养基选择作用机制是以纤维素粉为唯一碳源，只有纤维素分解菌才能生存。

3.你能否设计一个对照试验，说明选择培养基的作用？

答：若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将纤维素粉改为葡萄糖。

活动5：阅读资料三“刚果红染色法”，填表比较两种染色法的各自的优缺点：

〖思考5〗为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

答：在选择培养条件下，可使能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。

3．结果分析与评价

活动6：阅读“课题延伸”，回答：

3．1为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行

发酵产纤维素酶

实验，纤维素酶的发酵方法有

液体

发酵和

固体

发酵。

3．2纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的

葡萄糖

含量进行定量测定。

课堂总结、点评

实例探究

例1．有关谷氨酸发酵的叙述中正确的是（

）

A．发酵中要不断通入空气

B．培养条件不当将不能得到产品

C．搅拌的唯一目的是使空气成为小泡

D．冷却水可使酶活性下降

解析：进行谷氨酸发酵的菌种是异养需氧型微生物，所以要在培养过程中不断通入空气，但是必须通入的是无菌空气，普通空气是不行的，容易造成杂菌污染。搅拌不但使空气成为小气泡以增加培养基中的溶氧量，还能使培养基与菌种充分接触，提高原料的利用率。在培养过程中，由于微生物的代谢产热和机械磨擦生热，会使培养基的温度升高，高到一定程度，就会使酶的结构和核酸的结构遭到破坏，培养会因此而受到影响。降低温度，是保证酶正常活性的条件之一而不会使酶的活性下降。当培养条件不恰当时，不能得到谷氨酸。如pH降低时将得到乙酰谷氨酰胺，溶氧低时将得到乳酸或琥珀酸。

答案：B

例2．温度对发酵过程的影响，不正确的是（

）

A．温度过高，发酵周期缩短，产量降低

B．温度不影响生物合成的途径

C．温度能影响菌种对营养物质的吸收

D．菌体生长和产物合成所需的最适温度不一定相同

解析：解答此题需要从以下几方面入手分析：第一，发酵过程需要适宜的温度，如果温度过高，酶很快失活，菌体衰老，发酵周期就会缩短，产量也会降低；第二，温度能影响生物合成的途径，这是因为生物合成过程需要酶，酶的活性与温度高低有关；第三，菌种吸收营养物质一部分是通过主动运输来完成的，需呼吸作用提供能量，这与温度有关；第四，菌体生长和产物合成需体内旺盛的代谢作基础，而用于生长繁殖和代谢产物生成的酶不同，因此所需的最适宜的温度也不一定相同。

答案：B

例3.淀粉酶可以通过微生物发酵生产，为了提高酶的产最，请你设计一个实验，利用诱变育种方法，获得产生淀粉酶较多的菌株。①写出主要实验步骤。②根据诱发突变率低和诱发突变不定向性的特点预期实验结果。

提示：生产菌株在含有淀粉的固体培养基上，随其生长可释放淀粉酶分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈。（2004天津理科综合能力测试）

解析：这是一道以诱变育种、选择培养和鉴别培养等知识为载体的实验设计题，综合性强，难度较大。既要求学生掌握实验原理，也要求学生具备较强的实验设计的能力及对实验结果的预测和分析能力。

答案：

①主要实验步骤：

第一步：将培养好的生产菌株分两组。一组用一定剂量的诱变剂处理，另一组不处理做对照。

第二步：制备含淀粉的固体培养基。

第三步：把诱变组的大量菌株接种于多个含淀粉的固体培养基上，同时接种对照组，相同条件下培养。

第四步：比较两组菌株菌落周围透明圈的大小，选出透明圈变大的菌株。

②预期实验结果：

a．由于诱发突变率低，诱变组中绝大多数菌落周围的透明圈大小与对照组相同。

b．由于诱发突变不定向性，诱变组中极少数菌落周围的透明圈与对照组相比变大或变小。

【巩固练习】

1．下面是弗来明对青霉素的早期研究过程：

发现问题：在培养细菌的器具中发现一种青霉菌，在这种青霉菌的周围有没有其它细菌生存?为什么会产生这种现象? 提出假设：

设计实验：在液体中培养青霉菌后，考察这种液体对细菌增殖的影响。

实验结果：培养液使细菌的增殖停止。

结论：下面几项最适合作为该实验假设的是（

）

A．青霉菌与细菌之间是共生关系

B．青霉菌污染了细菌生存的环境

C．青霉菌产生了对人体有益的物质

D．青霉菌能产生抑制细菌增殖的物质

2．培养流感病毒时，应选用（

）

A．固体培养基

B．含有多种无机盐的培养液

C．活的鸡胚

D．无菌的牛肉汤

3．以下关于微生物对氧的需求的叙述中正确的是（

）

A．产甲烷杆菌属厌氧呼吸，但氧的存在不影响其生存

B．链球菌进行厌氧呼吸，不能接触空气

C．黄色短杆菌在氧气充足时才能产生谷氨酸

D．谷氨酸棒培育杆菌是厌氧呼吸

4．可以使微生物细胞内蛋白质、核酸发生不可逆破坏的环境加素是（

）

A．高温

B.营养成分的变化

C.氧含量

D.温度、pH、氧的共同作用

5．微生物（除病毒外）需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。下列有关微生物营养的说法正确的是（

）

A．乳酸菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的

B．微生物生长中不可缺少的一些微量的无机物称为生长因子

C．培养基中的营养物质浓度越高对微生物的增殖越有利

D．生长因子一般是酶或核酸的组成成分，微生物本身合成这些生长因子的能力往往不足

6．下列有关味精生产的一些措施的叙述，正确的是（

）

A．常用的菌种是谷氨酸棒状杆菌和金黄色葡萄球菌

B．培养基是含有五种营养成分的合成培养基

C．在发酵中要控制的只是温度、pH、通气量

D．味精是谷氨酸经Na2CO3中和后，再经过过滤、浓缩、离心分离而成

7．菌落形成的根本原因是（

）

A．细菌有鞭毛

B．细菌能运动

C．培养基有琼脂

D．子细胞成为群体

8．在接种操作的过程中，不正确的是（

）

A．要将接种环灼烧灭菌

B．取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌

C．将接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位

D．接种后还要将管口灭菌加塞

9．高压蒸气灭菌的原理是（

）

A．高压使细菌DNA变性

B．高压使细菌蛋白质凝固变性

C．高温烫死细菌

D．高温使细菌DNA变性

10．某种细菌每30分钟分裂一次，开始接种时为3个细胞，在对数生长期培养5个小时后，问此时有多少细胞？

A．15

B．48

C．1024

D．3072 答案：1—5

DCCAD

6—10

DDCBD

作

业

教

学

后

记