课题3　血红蛋白的提取和分离PPT专用课堂实录内容

课题3 血红蛋白的提取和分离

教材内容解读

要点1 如何分离不同种类的蛋白质

根据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质。如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等。

要点2 凝胶色谱柱

（1）定义

凝胶色谱法也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

（2）凝胶

所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。

（3）分离原理

在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分于质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

要点3

缓冲溶液

（1）缓冲溶液的缓冲作用

在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

（2）缓冲溶液的意义

生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外的pH与体内的基本一致。

要点4 电泳

（1）定义

电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

（2）电泳原理

许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分于带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

（3）电泳过程中影响粒子运动快慢的因素

①粒子带电荷的多少。粒子带电荷越多在电场中运动越快。

②粒子的质量。粒子质量越小在电场中运动越快。

③粒子的形状。呈球形或近球形的粒子比链状粒子运动快。

（4）荷质比

粒子在电泳时运动的快慢主要取决于电荷与质量比，简称荷质比。荷质比值越大的粒 子电泳时运动越快。

要点5 实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

1

血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的组成中，约90%是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成，包括两个-肽链和两个-肽链

（1）样品处理

①红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r／min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

②血红蛋白的释放

将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。

蒸馏水和甲苯作用：使红细胞破裂释放出血红蛋白。

③分离血红蛋白溶液

将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r／min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。

将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

④透析

取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。

(2)凝胶色谱操作

①凝胶色谱柱的制作

②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用

蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。

③样品的加入和洗脱

打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕

2

移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol／L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。

④注意事项

在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。

如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。

要点6 疑难解答

从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀? 凝胶色谱的分离时，相对分子质量较大的蛋白质分于只能从颗粒之间向下移动，通过的路程较短，移动速度较快，相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢．因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

3