课题3　血红蛋白的提取和分离优秀教案

血红蛋白的提取和分离

【教学目标】

（一）知识与能力目标

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白。

2、说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

（二）能力目标

通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤，培养学生理论联系实际的能力；

（三）情感态度目标

通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神；

【教学重难点】

重点：凝胶色谱法的原理和方法

难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

【教学方法】

启发式教学

【教学工具】

多媒体课件

【教学过程】

一、基础知识

【活动1】阅读教材P64第1自然段和“凝胶色谱法”部分，讨论并回答下列问题：

1．（理解）提取和分离蛋白质的原理：利用蛋白质的各种理化特性（如形状、大小、电荷性质和电量、溶解度、吸附性和亲和力等）的差异，将不同的蛋白质分离开来。

2．（记忆）凝胶色谱法是根据相对分子量的大小分离蛋白质的一种有效方法。

3．（理解）凝胶大多数是由多糖化合物（如葡聚糖、琼脂糖等）构成的微小多孔球体。当相对分子量不同的蛋白质分子通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相反，相对分子量较大的蛋白质在凝胶颗粒外部移动，路程较短，移动速度较快。

【活动2】阅读教材P65 “缓冲溶液”部分，讨论并回答下列问题：

1．（理解）在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，而保持pH基本不变。

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2．（记忆）缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水配制而成。调节缓冲剂的使用比例可以制成在不同pH范围内使用的缓冲液。

【思考1】维持人体血液pH稳态的缓冲对有H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4。

【活动3】阅读教材P65 “电泳”部分，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

2．（记忆）在一定的pH下，许多生物大分子上可解离的基团就会带上正电或负电。

3．（理解）在电泳过程中，决定带电分子迁移方向的是带电分子带电性质的差异，决定带电分子迁移快慢的是带电分子形状、大小、电量的不同。

4．（记忆）常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。为了消除样品分子原有净电量对迁移速率的影响，可以在凝胶中加入SDS，使样品分子的迁移速率完全取决于分子的大小。

二、实验操作

【活动4】阅读教材P66最后自然段和P67“样品处理”部分，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）蛋白质的提取和分离的一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

2．（学会）红细胞的洗涤：洗涤的目的是除去血浆中的杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

为防止血液凝固，应预先加入柠檬酸钠；所用洗涤液是五倍于红细胞液的生理盐水；洗涤中用玻璃棒缓慢搅拌，用离心机低速短时离心；洗涤干净的标准是上清液没有黄色。

3．（学会）血红蛋白的释放：释放的目的是将血红蛋白从红细胞中释放出来。

在红细胞液中加入等体积的蒸馏水和40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌。

4．（学会）分离血红蛋白溶液：目的是从红细胞破碎混合液中分离出血红蛋白溶液。

将红细胞破碎混合液进行高速离心处理后，离心管中从上到下依次是：无色透明的甲苯层、白色固体的脂溶性沉淀层、红色透明的血红蛋白溶液层和暗红色的破碎物沉淀层。用滤纸过滤以除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置后分离出血红蛋白溶液。

5．（学会）透析：透析的目的是除去血红蛋白溶液中的无机盐离子和有机小分子物质。

将血红蛋白溶液装入透析袋中，放入磷酸缓冲液中透析12h.。

【活动5】阅读教材P67“凝胶色谱操作”部分，讨论并回答下列问题：

1．（了解）凝胶色谱柱的制作。

2．（学会）凝胶色谱柱的装填：实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶（G－75），其中G表示交联程度、膨胀程度和分离范围；75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。

将凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内，使凝胶装填均匀并不能有气泡存在。然后用磷酸缓冲液充分洗涤平衡12h，使凝胶装填紧密。

3．（记忆）样品的加入和洗脱：用吸管沿管壁将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏凝胶- 2 -

面。待红色的蛋白质接近色谱柱底部时，用试管连续收集，每试管收集5mL流出液。

三、操作提示

【活动6】阅读教材P69“操作提示”部分，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）洗涤红细胞时，离心速度过高或离心时间过长，会使白细胞等一同沉淀。

2．（记忆）为了加快凝胶膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，不仅节约时间，还能除去凝胶中的微生物和空气。

3．（记忆）凝胶色谱柱中不能存在气泡，原因是气泡会扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序。

【活动7】观看视频：观看“血红蛋白的提取与分离”视频，体会并学会相关技术和方法。

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