课题3　分解纤维素的微生物的分离课堂实录【2】

课题3 分解纤维素的微生物的分离教学设计

一、纤维素与纤维素酶（阅读教材P27～28）

1．纤维素

(1)化学本质：由C、H、O三种元素组成，基本组成单位是葡萄糖，是地球上含量最丰富的多糖类物质。

(2)来源：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外木材、作物秸秆等也富含纤维素；纤维素是构成植物细胞壁的主要成分之一。

2．纤维素酶

(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，即C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。

(2)作用原理

(3)实验验证纤维素酶的作用

试管

滤纸条

1 cm×

6 cm 1 cm×

6 cm 缓冲液

pH＝4.8 10 mL 纤维素酶

(70～

80 U/mL) 1_mL 条件

结果

完全

分解

基本无

变化

1 2 11 mL / 将两支试管固定在50 mL 的锥形瓶中，在摇床上以

140 r/min的转速振荡反

应1 h 二、纤维素分解菌的筛选（阅读教材P28）

1．方法

2．原理

三、实验设计和操作（阅读教材P28～29）

1．土壤取样：选择富含纤维素的环境。

2．选择培养

(1)目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离到所需要的微生物。

(2)操作方法：将土样加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2_d，直至培养液变混浊，也可重复选择培养。

3．梯度稀释

4．涂布培养：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。

5．筛选菌株：刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落。

四、课题延伸——纤维素分解菌的鉴定 （阅读教材P30）

1．为确定得到的透明圈中的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。

2．纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。

[总结] 两种刚果红染色法的比较

项目

内容

方法一

培养基上长出菌落→覆盖质量浓

10～15 min度为1 mg/mL的CR溶液――

→

过程

倒去CR溶液→加入NaCl溶液

15 min――→倒掉NaCl溶液→出现透

明圈

优点

显示出颜色反应基本上是纤维素

分解菌的作用

操作简便，不存在菌落混

杂问题

①由于琼脂、土豆汁中均含有

淀粉类物质，可能使产生淀粉

酶的微生物也形成透明圈，即

假阳性反应；②有些微生物具

有降解色素的能力，它们会降

解刚果红形成透明圈，与纤维

素分解菌不易区分

配制CR溶液→灭菌→按照

1 mL CR/200 mL培养基比例

混匀→倒平板→培养→出现

透明圈

方法二

缺点

制作繁琐，加入刚果红会

使菌落之间发生混杂

[练习] 1．下列有关刚果红染色法的叙述，不正确的是(

) A．刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入

B．刚果红可以在菌落形成后加入

C．在菌落形成前倒平板时加入，刚果红不需要灭菌

D．在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌

解析：选C 利用刚果红筛选纤维素分解菌时，刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入。在细菌菌落形成前倒平板时加入，要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌。

[探究] 1．实验流程

土壤取样→选择培养(此步可省略)→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。

(1)涉及的生物技术

主要有培养基的制作、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基的作用、土壤取 样等。

(2)实验步骤剖析

①土壤取样

采取土样时，可以选择富含纤维素的环境。由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，因此从这种环境中获得目的微生物的概率要高于普通环境。

②选择培养

a．目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。

b．操作方法：将土样加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2_d，直至培养液变混浊，也可重复选择培养。

c．在分离分解纤维素的微生物的实验流程中，进行选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度；使能够适应人工设置的营养条件的微生物得到迅速地繁殖，而不适应的微生物的繁殖得到抑制。选择培养的环节是否需要设置，可根据样品中目的微生物数量的多少来确定。

③为什么对挑选产生透明圈的菌落作进一步的鉴定？

提示：产生透明圈的菌落可能是能产生淀粉酶的微生物，也可能是能降解刚果红的菌种，所以需要进一步鉴定。

2．两种培养基

纤维素分解菌的选择培养基配方1 纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏

水解酪素

鉴别纤维素分解菌的培养基配方2 CMC－Na 酵母膏

KH2PO4

琼脂

土豆汁

5～10 g 1 g 0.25 g 15 g 100 mL 5 g 1 g 1.2 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL (1)功能方面：

①培养基配方1为纤维素分解菌的选择培养基，该培养基中的唯一碳源是纤维素粉，只有能利用它的纤维素分解菌才能生存。

②培养基配方2为纤维素分解菌的鉴别培养基。在该培养基中加入刚果红溶液，在该培养基上生长的纤维素分解菌分泌纤维素酶，因此菌落周围会形成透明圈。

(2)物理性质方面：

①培养基配方1为纤维素分解菌的液体培养基，利用这种培养基可以增加纤维素分解菌的浓度。

②培养基配方2为纤维素分解菌的固体培养基，原因是添加了琼脂成分，可以在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。

(3)若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将纤维素粉改为葡萄糖。

3．分解纤维素微生物的分离实验的三个易误点

(1)培养基的制作是否合格：对照的培养基在培养过程中没有菌落生长，则说明培养基制作合格。

(2)选择培养基是否筛选出菌落：如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

(3)分离的结果是否一致：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

[总结] 1．对纤维素分解菌筛选流程的说明

(1)为确定得到的细菌是否是纤维素分解菌，还需进行发酵产生纤维素酶的实验。因为形成透明圈的菌落与其他微生物菌落可能出现混杂现象，而且产生透明圈的菌落可能是产生淀粉酶的微生物，也可能是降解刚果红的菌种。

(2)流程中的“选择培养”是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定。

(3)本实验的流程与课题2的流程有一定的区别。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。

2．纤维素分解菌的筛选过程中所用两种培养基的比较

(1)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，利用液体培养基能使营养成分充分消耗，以增加纤维素分解菌的浓度。

(2)纤维素分解菌的鉴别培养基为固体培养基，因为需要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。

(3)在上述选择培养基中能以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长；而在上述鉴别培养基中，绝大多数微生物都可以正常生长。

【易错易混】

判断某个选择培养基是否具有选择作用时，应设立基础培养基进行对照；若判断所使用的培养基灭菌是否彻底，应设立不接菌种的该培养基进行空白对照。

[练习] 2．下列关于分离纤维素分解菌的实验的叙述，错误的是(

) A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

B．选择培养这一步可省略

C．经稀释涂布平板后，用刚果红对长出菌落的培养基染色

D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上

解析：选A 经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；选择培养可省略；经稀释涂布平板后，用刚果红对长出菌落的培养基染色；设置对照能证明经选择培养的确得到了欲分离的微生物。