课题3　血红蛋白的提取和分离优质课一等奖

专题五 课题3 血红蛋白的提取和分离

一、基础知识

（一）凝胶色谱法

1.凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。

2.凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。

3.在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

（二）缓冲溶液

1.缓冲溶液的作用是能够抵制外界酸或碱对溶液PH的影响，维持PH基本不变。

2.缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成的。

3.生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。

（三）电泳

1.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

2.许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

3.两种常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，在凝胶中加入SDS，电泳速率完全取决于分子大小。在测定蛋白质分子量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

二、实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

（一）样品处理

1.红细胞的洗涤：洗涤目的：是去除杂蛋白。洗涤过程：血样→低速短时间离心→吸出上层透明的黄色血浆→下层暗红色红细胞+生理盐水→缓慢搅拌→低速短时间离心。如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。

2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

3、分离血红蛋白溶液：混合溶液离心后分为4层：从上至下：第1层为无色透明的甲苯层，第1层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

（二）粗分离：透析

血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入磷酸缓冲液（PH7.0）中，透析12h。

透析的目的：去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。

（三）纯化：凝胶色谱操作：制作凝胶色谱柱→装填凝胶色谱柱→样品的加入和洗脱→纯度鉴定

三、常见问题：

1.从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？

(各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。

) 2.SDS聚—丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？

(否。因为SDS能与蛋白质结合，形成蛋白质－SDS复合物，SDS它所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。) 3.洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？

(不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红

蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。

) 4.在血红蛋白释放过程中，蒸馏水和甲苯的作用分别是什么？( ①蒸馏水可以使红细胞吸水涨破，释放细胞内的血红蛋白；

②

细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速瓦解细胞膜，红细胞破裂并释放出血红蛋白。) 5.将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中透析的原理是什么？怎样加快透析速率？(原理：透析袋能使小分子自由进出，大分子不能通过而在保留在袋内。及时更换缓冲液或增大缓冲液的量) 6.试从凝胶色谱的分离原理分析，凝胶的装填为什么要紧密、均匀、不得有气泡存在？

(如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的洗脱次序，降低分离的效果。)

7.凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？

(不能。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，移动距离较近，移动速度较快，先洗脱出来；但相对分子质量较小的蛋白质可能进入凝胶颗粒内部，也可能不进入，导致部分相对分子质量较小的蛋白质可能与相对分子质量较大的蛋白质一起洗脱出来。)

8.洗涤后的红细胞不纯净原因是什么？血红蛋白离心后分层不明显的原因是什么？

离心速度过高或时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀而造成

。

洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。)

9.

实验要取新鲜的血液，要在采血容器中预先加入柠檬酸钠，加入柠檬酸钠的目的是什么？(防止血液凝固) 10.血红蛋白有什么特点？这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？(血红蛋白呈现红色，在凝胶色谱分离时，可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液；这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。)