课题3　血红蛋白的提取和分离优秀课堂实录

课题3 血红蛋白的提取和分离教学设计

【教学目标】

（一）知识与技能

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

（二）过程与方法

体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤

（三）情感、态度与价值观

初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神

【教学重点】

凝胶色谱法的原理和方法

【教学难点】

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

【教学方法】

启发式教学

【教学工具】

多媒体课件

【教学过程】

（一）引入新课

蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？

（二）进行新课

一．基础知识

蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

(一)．凝胶色谱法（分配色谱法）：

1.凝胶：

一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）

2.概念：

根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法

3.原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

4.分离过程：（图5－13b）

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

（二）．缓冲溶液

1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

2.原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

3.缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

（三）．电泳：

1.概念：

带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

2.原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

［思考］阅读教材后，填写下表：

决定运动形成库形成决定运动

方向

仑力

阻力

速率

电荷

√

性质

电荷√

√

量

分子√

√

形状

分子√

√

大小

3.分离类型：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。

4.聚丙稀酰胺凝胶电泳是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。

二．实验设计

（一）.样品处理及粗分离

思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？

不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。

1.选择实验材料

你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？

哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。

2.请阅读教材，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题：

血液由

和

两部分组成。

血细胞中

细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是

。

该化合物是由

和

构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的

基团。

3.从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？

除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。

红细胞的洗涤过程为

血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水

→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄

色

思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？

加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。

补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：

红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白

4.. 如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。

透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。

思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？

维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。

总结：通过以上基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――

（二）凝胶色谱操作---纯化

1..凝胶色谱操作。

凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。

根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。

橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。

色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱

下面进行第二步――凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：

2.色谱柱的装填过程。

步骤

操作要求

①操作要求

色谱柱垂直固定在支架上

②计算称量凝胶

根据色谱柱体积计算凝胶用量

凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀

③配制悬浮液

凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

④装填悬浮液

一次性缓慢倒入；轻轻敲打

缓冲液洗涤平立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡⑤12h 衡

样品加入和洗脱。其基本过程是：

调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质

至此，血红蛋白即可得到分离。

三、纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定（选做）。

四、实验结果分析与评价

五、实验注意事项：

1.电泳技术

电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

2.

红细胞的洗涤

如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

3．如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。

此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

4．为什么凝胶的装填要紧密、均匀？

如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

5．沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的

不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。

6．G-75 “G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。

7．装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密

8．加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

9．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义

哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

10．如何检测血红蛋白的分离是否成功

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

课堂总结、点评

血

红

蛋

白

的

提

取

和

分

离

蛋白质分子的差异性

凝胶色谱法

凝胶电泳法

缓冲溶液

蛋白质的

提取分离

组

成

原

理

分离过程

作

用

样品处理

纯度鉴定

粗

分

离

纯

化

当堂反馈

1. 凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（

D

）

A. 对其他分子的亲和力

B. 溶解度

C. 所带电荷多少

D. 相对分子质量的大小

2. 凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（

A

）

A. 糖类化合物

B. 脂质

C. 蛋白质

D. 核酸

3. 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（

A

）

A. 相对分子质量大的

B. 溶解度高的

C. 相对分子量小的

D. 所代电荷多的

4. 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（

D

）

A. 甲苯

B. 血红蛋白水溶液

C. 脂溶性物质的沉淀层

D. 其他杂质的沉淀

5. 下列操作正确的是（

D

）

A. 分离红细胞时采用低速长时间离心

B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可

C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心

D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h 6. 样品的加入和洗脱的叙述正确的是（

C

）

A. 先加入1ml透析后的样品

B. 加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出

C. 如果红色带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功

D. 洗脱时可以用缓冲液也可以用清水

7. 下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（

B

）

A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D. 可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

8. 凝胶色谱法操作正确的是（

A

）

A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴

B. 将橡皮塞下部切出凹穴

C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面

D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片

9. 样品的加入和洗脱的操作不正确的是（

D

）

A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

【板书设计】

课题3 血红蛋白的提取和分离

一．基础知识

1、凝胶色谱法

2、缓冲溶液

3、电泳

二．实验设计

1、样品处理及粗分离

2、凝胶色谱操作

三、纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定（选做）。

四、实验结果分析与评价

五、实验注意事项：

【教学反思】

在本节知识中，首先将蛋白质的提取和分离的主要方法和原理作为重点复习内容。按照由简单到复杂、由熟悉到陌生的原则进行复习。首先引导学生如何处理样品，将血红蛋白释放出来，并进行粗分离，最后再引导学生分析如何利用已学的方法将血红蛋白与其他蛋白质的混合溶液进行纯化，并进行血红蛋白的纯度鉴定。对比较复杂的电泳法，主要是从原理的层次进行理解；对凝胶色谱法，则借助于凝胶色谱柱的示意图讲解。在教学中通过层层设问的形式，有利于学生在理解的基础上进行记忆。