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DNA指纹的遗传分析

【实验原理】

“DNA指纹”是指可以利用DNA差异来进行与传统指纹分析相似的身份识别。DNA指纹是以DNA的多态性为基础，而卫星DNA的发现则是其最重要的奠基石。卫星DNA是由一短序列（即重复单位或核心序列）多次重复而成，因此也有人称其为可变数目串联重复序列（variable numbers of tandem reprat，VNTR）,在人类基因组中存在多种由不同重复单位组成的卫星DNA，重复单位的碱基序列在不同个体中具有高度的保守性，而卫星DNA的多态性则来源于重复单位的重复次数不同，并形成了众多的等位基因。例如，人类1号染色体上的VNTR D1S80，核心序列由16个核苷酸组成，拷贝数在14～41个之间，已知29种不同的等位基因。

1984年Jefferys等人首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人类核DNA的酶切片段杂交，产生了由10多条带组成的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置就像指纹一样因人而异，因而Jefferys等人称之为DNA指纹图谱。产生DNA指纹图谱的过程叫做DNA指纹分析，目前包括PCR、RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）和RAPD（随机扩增多态性DNA）等方法。

DNA指纹图谱的基本特点：

（1）多位点性：基因组中某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。

（2）高变异性：DNA指纹图谱反应的是多个位点上的等位基因的特征，具有很高的变异性。发现两个无血缘关系个体具有相同DNA指纹图谱的概率仅为5×10-19，因此，除了同卵双胞胎，几乎不可能有两个人的DNA指纹图谱完全相同。

（3）稳定的遗传性：DNA指纹图谱中的谱带能够稳定遗传，杂合带遵守孟德尔遗传规律。子代DNA指纹图谱中产生与双亲都不同的新带的概率（基因突变）仅在0.001～0.004之间。DNA指纹图谱还具有体细胞稳定性，即用同一个体的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等的DNA作出的DNA指纹图谱是一致的。

由于DNA指纹图谱具有这些显著的特征，他已经成为最具吸引力的遗传标记。Jeffreys是第一个意识到DNA指纹可以建立个人身份识别系统的人，并且首先将其用于亲子鉴定，移民审查和凶杀侦破。1989年该技术获美国国会批准作为正式法庭物证手段。此外，它还被用于医生诊断及寻找与疾病连锁的遗传标记，探明动物种群的起源及进化过程，在作物的基因定位及育种上也有非常广泛的应用。

【实验材料】

人类口腔细胞。

【实验仪器与试剂】

1．仪器

微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，漩涡振荡器，PCR仪，电泳仪，电泳槽，透射式紫外分析仪（或凝胶成像仪）。

枪头，1.5mL，0.2 mL离心管，棉签，使用前均需121℃高温灭菌

2．试剂

NaCl，琼脂糖，溴化乙锭，Na2-EDTA，SDS，Tris，Proteinase K，冰醋酸，溴酚蓝，二甲苯腈蓝，蔗糖，甘油，DNA相对分子质量标记，Chelex 100树脂（Bio-Rad），PCR pre-mix(TaKaRa)。

3．溶液配制

（1）5% Chelex树脂

Chelex 100(Bio-Rad) 0.5g 50mmol/L Tris-HCl 10mL 用4mol/L NaOH调pH至11，室温可保存3个月，使用前充分混匀。

（2）2.0％琼脂糖凝胶：称2.0g琼脂糖放入250ml三角烧瓶，加入1×TAE溶液100mL微波炉加热溶解，冷却至60℃左右加入1μg/mL溴化乙锭（EB），缓慢混匀后倒胶板。

（3）溴化乙锭（EB）：用无菌水配制5mg/mL储藏液，工作浓度1μg/mL。

注意；溴化乙锭为诱变剂，有致癌作用。配制、稀释和染色时必须戴手套。

（4）0.5mol/L EDTA(pH8.0) Na2-EDTA 18.61g NaOH 2g 蒸馏水定容至100mL，室温保存。

（5）10×TAE电泳缓冲液

Tris 48.4g 冰醋酸 11.42mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20mL 蒸馏水定容至1000mL，室温保存。

（6）10×上样缓冲液（Loading dye）

溴酚蓝 0.25g 二甲苯腈蓝 0.25g 蔗糖 50.00g（或甘油50mL）

用60mL无菌水（用甘油50mL时，49mL）溶解上述试剂，再定至100mL,室温保存即可。

（7）10%SDS：SDS 10g用无菌水溶解后（可加热），定容至100mL，室温保存。

（8）蛋白酶K溶液

20mg/mL蛋白酶K水溶液 5mL 10%SDS 1mL 无菌水 94mL 冰箱冷藏。

（9）无菌水：蒸馏水或去离子水，高温灭菌。

（10）1mol/L Tris-HCl(pH8.0)：将12.1g Tris溶解在80mL蒸馏水中，加盐酸调节pH至8.0，加蒸馏水定容至100mL。

4．引物

Primer1：5’-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3’

Primer2：5’-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3’

【实验操作】

1．收集DNA样本

（1）先漱口，然后用灭菌的牙签充分擦刮口腔内壁，将该牙签放入1.5mL装有1mL无菌水的小离心管中，使粘附在牙签表面的口腔细胞悬浮其中（以能看到悬浮物为好）。震荡10s，10000 r/min离心1min。

（2）从离心管中吸出970μL无菌水，注意不要吸到沉淀。

（3）向离心管中加入200μL 5% Chelex 100，震荡10s混匀。

（4）加入2μL蛋白酶K，混匀，56℃保温5min。

（5）剧烈震荡10s,沸水浴8min。

（6）10000r/min离心3min，离心管中溶液分成上下两层：下层为Chelex100和细胞碎片的沉淀，上层溶液含DNA分子，可以直接用作PCR模板。

此DNA样本可在4℃或-20℃保存，必要时可在使用前再次加热并离心，使管内物质分层。

2．PCR扩增D1S80等位基因

（1）每个人用记号笔在0.2mL PCR管上做好标记。

（2）准备冰盒，开始反应前尽量使PCR管保持在冰上。

（3）依次加入下列成分，配制25μL体系的PCR反应溶液：

PCR pre-mix 12.5μL 引物1 1μL 引物2 1μL 口腔细胞DNA样本 10μL 加无菌水至总体积25uL。

（4）轻弹管壁，混匀溶液。

（5）离心10s，使管壁上的液滴落下。

（6）按下列程序开始PCR反应：

94℃，1 min 

94℃，15s 68℃，15s 72℃，15 s 30个循环



72℃，10min 

4℃暂时放置，直至开始电泳

3．PCR扩增产物鉴定与D1S80等位基因分析

（1）准备冰盒。

（2）取出完成反应的PCR管，放冰上待用。

（3）取出10µLD1S80 PCR扩增产物放入0.5mL离心管。

（4）加入2µL上样缓冲液。

（5）轻弹管壁混匀，再瞬时离心，使管壁上的液滴下落。

（6）用1×TAE电泳缓冲液配制2.0%琼脂糖电泳凝胶。

（7）60V预电泳1～2min。

（8）在凝胶上选一孔加入6µL的DNA相对分子质量标记（DNA100bp Ladder）。

（9）每人将刚刚准备好的10µLD1S80 PCR扩增产物+2 uL的上样缓冲液各自加

入凝胶样孔，注意不要有气泡进入。

（10）60V电泳30～40min。

（11）取出凝胶用清水漂洗5～10min。

（12）凝胶用紫外分析仪观察，记录每个个体的DNA条带数目及其位置。

4．观察和分析D1S80多态性。

【

实验结果】

1 电泳结果图：

图1：电泳结果图

说明：a.条带1-6是marker的条带。

b.条带7-9是基因D1S80的条带。

2 marker的标准曲线的制作：

marker1标准带的相关曲线

条带

1 2 3 4 5 6 7 12 基因1031 900 80 0 700 600 500 400 300 250 200 150 1长度0/bp 0 Lg/bp 3.012.952.902.842.772.692.602.472.392.302.172 33 42 31 51 82 90 21 71 79 10 61 迁移1.92 2.02 2.14 2.25 2.35 2.51 2.68 2.85 2.98 3.10 3.22 3距离./cm 38 8 9 10 11

图4：marker 1的标准曲线

根据图4算出marker 2的相关数据：

marker 2的相关数据

条带

1’

2’

3’

4’

迁移距离1.41 /cm Lg/bp 3.39145 1.64 3.23975 1.98 3.01551 2.26 2.83083 5’

2.67 2.56042 6’

3.07 2.2966 基因长度2462.918 1736.800 1026 677 363 197 /bp

所以可以估算出条带1’~6’的标准分子量大概为2400、1700、1000、700、400、200。

将这一组数据应用到实验结果中marker标准曲线的绘制上，显然会给实验结果带来很大的影响。但又不可避免。

marker标准条带的相关数据

条带

1 2 3 4 5 6 基因长度/bp lg/bp 迁移距离/cm

2400 1700 1000 700 400 200 3.3802 3.2304 3.0000 2.8451 2.6021 2.3010 1.22 1.41 1.69 1.95 2.28 2.64

图2 marker的标准曲线

3成员A、C、D的D1S80的计算：

根据marker的标准曲线知

表2： 图1中编号ACD的相关数据

条带

A(7) C(8) D(9) 迁移距离/cm lg/bp 基因长度

4结果记录表：

表3： 结果记录表

D1S80 DNA指纹特征

小组成员

大小/bp 长度（重复数）

杂合/ 纯合

A 425 18 纯合

B ----- ----- ----- C 390 15 纯合

D 358 13 纯合

E ----- ----- ----- F ----- ----- ----- 2.22 425 2.27 390 2.32 358 2.62818 2.59086 2.55354 【实验分析及讨论】

A从图1可知小组成员里只有A、C、D有正常的条带，而且全是纯合体，而B、E、F并没有出现正确的条带，分析可能原因：a在取样时取得太少了，致使提取的DNA浓度过低，在该实验的PCR条件下30个循环不能得到正确的DNA分子拷贝。b取样不合适，可能在去口腔上皮时并没有在适合的位置取，导致取出来的并不是口腔上皮。c在操作过程中一些错误的步骤导致没有提出正确的DNA分子。

B图1中最下面的有一排亮亮的条带。据分析是PCR体系里引物的条带。但是我们可以发现与B、E、F相比，A、C、D对应的条带最亮最宽，说明引物的含量较多，但是偏偏 A、C、D有正确的条带。这似乎说不通，但是进一步的分析可以推测有以下两种原因：a在向Pcr小管里加入体系时，由于移液枪不准造成的加入体系不同，但这种概率较小。b在向胶孔加入样品时由于加入量不同造成的结果。这个显然比第一种出现的概率要大得多。

C原理中我们指出人类1号染色体上的VNTR D1S80，核心序列由16个核苷酸组成，拷贝数在14～41个之间，已知29种不同的等位基因。但是我们的实验结果里D的拷贝数为13，却小于14，由于两者比较接近所以将D的拷贝数应该认为是14，而出现这种偏差的原因可能在于：a marker标准的分子量我们是用的周五晚上组的图估算出来的(如图3)，并不是说明书上标准的，所以marker的标准曲线与实际的可能有一定的差距，这样就会导致最后的结果也会有一定的差距。b在photoshop CS3软件测量距离时，并没有专业的分析距离的功能，而是利用相关功能读出来的，所以这可能会给结果带来很大的偏差。

D如果一个个体的两个D1S80等位基因之间相差一个重复，不可以用琼脂糖凝胶电泳检测。原因是在实验中我们用到的缓冲液是1*TAE，1.5%的琼脂糖。根据相关资料显示这种胶的的分辨率在80bp~4kb，而一个重复是16bp，所以我们不可以用琼脂糖凝胶电泳检测。

F用PCR、RFLP、RAPD方法产生DNA指纹图谱各有利弊：PCR方法简单，但不准确，还需要设计引物.RFLP利用酶的特异性给为准确快速，缺点有RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制。RAPD利用随机的引物原理简单，快速，弊端有RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离。