课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优质课一等奖教案

土壤中的分解尿素的细菌的分离与计数

教学目标

知识与技能

1.利用选择培养基分离细菌。

2.运用相关技术解决生产生活中有关微生物计数的问题。

过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性。

情感态度与价值观

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯。

重点与难点

重点：对土样的选取和选择培养基的配置。

难点：对分解尿素的细菌的计数。

教学过程：

一、课题背景

1、尿素的利用

尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。

2、细菌能利用尿素的原因

土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶。

二、研究思路

（一）筛选菌株

1、实例： PCR技术

DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制(PCR)的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。

思考：到哪里寻找耐高温的DNA聚合酶？

提示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。那么如何寻找分解尿素的细菌？

课件展示本课题使用的培养基配方，学生观察思考：

①从物理性质看此培养基属于哪类？②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？③此培养基能分离出尿素分解菌吗？原理是什么？

2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

选择培养基：允许特定种类微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物的生长。

类型及作用原理

（1）在培养基中加入某种化学物质。如加入青霉素可分离酵母菌和霉菌。

（2）改变培养基中的营养成分（如培养基缺乏氮源，可分离固氮菌）；或者某种营养成分为特定化学成分（分离尿素分解菌即是这种类型）。

（3）改变培养条件。如高温。

（二）统计菌落数目

1、显微镜直接计数：利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

缺点：不能区分死菌与活菌。

2.间接计数法（活菌计数法）

⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。

⑵常用方法：稀释涂布平板法。

思考：①重复实验，说明设置重复实验的重要性，如何设置重复实验？

②如何从平板上的菌落数，推测出每克样品中的菌落数？

学生讨论，回答问题。

总结：①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。

②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

（三）设置对照

活动：分析课本A同学和其他同学的实验结果。

A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种：一是由于土样不同；二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。

方案一：可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。判断1、培养基中是否有杂菌污染：将未接种的培养基同时进行培养。

2、判断选择培养基是否具有筛选作用：完全培养基（营养成分齐全）接种后培养观察菌落数目。三、实验设计

1.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

2.制备培养基

思考：

取稀释倍数为103～107，

考虑对照组和重复组，共要制备多少个平板？

3.样品的稀释 4.取样涂布

5.微生物的培养与观察

思考：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？

答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。四、操作提示

[一]无菌操作

1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

[二]做好标记

注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。

[三]规划时间

五、结果分析与评价

（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落

对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。

（二）样品的稀释操作是否成功

如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。 （三）重复组的结果是否一致

六、课题延伸

1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到

伊红-美蓝

培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。