课题3　血红蛋白的提取和分离优秀教学设计

课题3 血红蛋白的提取和分离

一、基础知识(阅读教材P64～P66) 1．凝胶色谱法

(1)概念：凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据

分离蛋白质的有效方法。

(2)原理

形态：微小的多孔球体①凝胶组成：大多数由多糖类化合物构成

结构：内部有许多贯穿的通道部的通道，路程较长，移动速度较慢②原理b.相对分子质量较大的蛋白质：无法进入凝胶内

部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快2．缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制

对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的

就可以制得

的缓冲液。

(3)意义：为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，保持

与体内环境中的pH基本一致。

3．电泳

(1)概念：带电粒子在

的作用下发生

的过程。

(2)原理

①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有

的基团，在一定的pH下，这些基团会带上

。

②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其

的电极移动。

③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子

以及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生

，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)常用的电泳方法：

电泳和

电泳。

二、实验操作(阅读教材P66～P69) 1．样品处理：通过

、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液等操作收集血红蛋白溶a.相对分子质量较小的蛋白质：容易进入凝胶内

液。

目的：去除杂蛋白(1)红细胞的洗涤方法：低速短时间离心

结果：直至上清液不再呈现黄色(2)血红蛋白的释放：在

的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。

(3)分离血红蛋白溶液

2．粗分离——透析

(1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液中，透析12 h。

(2)目的：将

的杂质除去。

(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将

保留在袋内。

3．纯化——凝胶色谱操作

制作凝胶色谱柱

↓

装填凝胶色谱柱：因为干的凝胶和用

的凝胶的体积差别很大，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填色谱柱时，不得有

存在

↓

样品的加入和洗脱

4．纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳：判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质

。鉴定方法中使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

蛋白质分离技术

探究1

结合下图分析凝胶色谱法分离蛋白质的原理

直径大小

运动方式

相对分子质量大

较大

垂直向下运动

相对分子质量小

较小

无规则的扩散运动

运动路程

运动速度

洗脱次序

较短

较快

先流出

较长

较慢

后流出

探究2

结合下图分析分离蛋白质的过程

(1)蛋白质混合物上柱；

(2)洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外；

(3)相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动；

(4)相对分子质量不同的蛋白质分子完全分开；

(5)相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。

凝胶色谱法和电泳法比较

凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来，而小分子后分离出来。电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。

凝胶色谱操作的分析

探究1

凝胶色谱柱的制作

(1)取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

(2)柱底部制作：选择适合的橡皮塞→橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。

(3)柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。

(4)将上述三部分按相应位置组装成一个整体。

探究2

凝胶色谱柱的装填

(1)计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量

↓

(2)凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液

↓

(3)固定：将色谱柱垂直固定在支架上

↓

(4)装填：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内

↓

(5)洗涤平衡：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密

探究3

样品的加入和洗脱

(1)打开流出口，使缓冲液与凝胶面平齐，关闭出口

↓

(2)用吸管将

1 mL样品加到色谱柱顶端，打开出口，使样品进入凝胶层后，关闭出口

↓

(3)小心加入物质的量浓度为

20 mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度后，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，开始洗脱

↓

(4)待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集

从实验现象观察的角度分析选用哺乳动物的红细胞作为实验材料的原因？

提示：哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和众多的细胞器，含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可通过观察颜色非常直观地来判断收集流出液的时期。

(1)红细胞的洗涤

①离心速度与离心时间十分重要，离心转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离的效果。

②重复洗涤三次，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法清除血浆蛋白。

(2)色谱柱填料的处理：为了加速干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需1～2 h。这种方法不仅节约时间，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排出胶粒内的空气。

(3)凝胶色谱柱的装填：在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。

①在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

②在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。

(4)蛋白质的分离：滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。根据红色区带的移动状况判断收集流出液的时间。

凝胶色谱法分离蛋白质中确定收集蛋白质时间的方法

(1)血红蛋白的收集：利用血红蛋白的颜色，当红色的蛋白质接近色谱柱底端时，就要收集流出液。

(2)其他无色蛋白质的收集：可以在实验时加入指示剂以掌握样品的移动位置，确定最佳的收集时机。

核心知识小结

[答题必备]

透析法分离蛋白质的目的是除去小分子杂质。

[要点回眸]

利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的先洗脱出来，相对分子质量小的后洗脱出来。

在电泳中，待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状都会影响分子的迁移速度。

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率完全取决于分子的大小。

蛋白质提取和分离的一般步骤是：样品处理与粗分离、纯化和纯度鉴定。

在对蛋白质进行纯度鉴定时，使用最多的方法是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

练习题1、下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图分析回答下列问题：

(1)甲装置用于

，目的是去除样品中

的杂质，图中A是

。B是

溶液。

(2)用乙装置分离蛋白质的方法叫

，

是根据

分离蛋白质的有效方法。

(3)乙装置中，C是

，其作用是

。

(4)用乙装置分离血红蛋白时，待

时，用试管收集流出液，每5

mL

收集一管，连续收集6管，图中试管序号表示收集的先后。经检测发现，试管②和试管⑤中蛋白质含量最高，则试管⑤中的蛋白质相对分子质量比血红蛋白

(填“大”或“小”)。

2、对蛋白质进行研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：

(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：

、

、

和纯度鉴定。

(2)在血红蛋白的提取与分离实验中，采集新鲜血液前要在采血容器中加入柠檬酸钠溶液的目的是

。

(3)样品的处理过程又可以细分为：红细胞的洗涤、

和分离血红蛋白溶液。其中分离血红蛋白溶液时需要用到

(仪器)分出下层红色透明液体。

(4)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析进行粗分离。

①透析的目的是

；

②透析的原理是

。

(5)装填凝胶色谱柱时，要注意色谱柱内不能有气泡，一旦发现有气泡必须重新装填。这是因为

。

(6)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

①样品纯化的目的是

；

②血红蛋白的特点是

；

这一特点对分离蛋白质的意义：

。

3、请完成下列有关血红蛋白的提取与分离的问题：

(1)洗涤红细胞的目的是

，采集的血样要及时采用

的方法分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的

液体倒入烧杯，再加入

，缓慢搅拌10 min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至

，表明红细胞已洗涤干净。为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂

。

(2)血红蛋白的释放过程中，在

的作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

(3)透析时，取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的

中，透析12 h。透析可以去除样品中

的杂质。

4、血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题：

(1)将实验流程补充完整。①

，②

。

(2)凝胶色谱法的基本原理是根据

分离蛋白质。

(3)洗涤红细胞的目的是去除

，洗涤干净的标志是

。

(4)分离血红蛋白时，由上到下第

层是血红蛋白溶液。

(5)如果红色区带

，说明色谱柱制作成功。

(6)相对分子质量测定：化学物质SDS能使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链。在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定量的SDS，电泳迁移率完全取决于肽链的分子大小。右图为本实验中用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血浆某白蛋白的结果。根据电泳结果，某同学得出“提取的血浆某白蛋白有两条肽链”的结论，这种说法可靠吗？

。理由是

。

1、对分子质量比血红蛋白小。

答案：(1)透析(粗分离)

相对分子质量较小

磷酸缓冲液

血红蛋白

(2)凝胶色谱法

相对分子质量的大小

(3)磷酸缓冲液

洗脱血红蛋白

(4)红色的蛋白质接近色谱柱底端

小

2、答案：(1)样品处理

粗分离

纯化

(2)防止血液凝固

(3)血红蛋白的释放

分液漏斗

(4)①去除相对分子质量较小的杂质

②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则被留在袋内

(5)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果

(6)①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂蛋白除去

②呈现红色

在用凝胶色谱法分离血红蛋白时，可以通过观察颜色来判断什么时期应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作

3、答案：(1)去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化

低速短时间离心

红细胞

五倍体积的生理盐水

上清液不再呈现黄色

柠檬酸钠

(2)蒸馏水和甲苯

(3)磷酸缓冲液

分子量较小

4、答案：(1)①血红蛋白的释放

②凝胶色谱柱的装填

(2)相对分子质量的大小

(3)杂蛋白(或血浆蛋白)

离心后的上清液不再呈现黄色

(4)三

(5)均匀一致地移动

(6)不可靠

只能得出提取的血浆某白蛋白含有两种大小不同的肽链，不一定是两条