课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数第一课时导学案

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、研究思路

1.筛选菌株

(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

(2)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

2.统计菌落数目

(1)活菌计数法：常用稀释涂布平板法。

①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。

M：代表稀释倍数。

③统计方法：为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。

(2)显微镜直接计数法：在显微镜下直接观察和计数微生物的数量。

3.设置对照

(1)对照实验：指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。

(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

二、实验设计

1.土壤取样

从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。先铲去表层土，在距地表约3～8 cm的土壤层取样。

2.样品的稀释

(1)稀释原因：样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。

(2)稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30～300之间，便于计数。

3.微生物的培养与观察

(1)培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。

(2)观察：每隔24_h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

三、操作提示

1.无菌操作

(1)取土样的用具在使用前都需要灭菌。

(2)应在酒精灯火焰旁称取土壤，并在酒精灯火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

(3)在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在酒精灯火焰旁操作。

2.做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好在使用前就做好标记。

3.制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率。

四、菌种鉴定

1.原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。

2．方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

核心要点一| 筛选菌株的原理及统计菌落数目的方法

1.筛选菌株的原理

(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。

(2)方法：

①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。

②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。

③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。

2.统计菌落数目的方法

微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示：

项目

直接计数法

利用特定细菌计数板或血细胞计原理

数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量

间接计数法

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中

大约含有多少活菌

主要用具

计数数据

优点

缺点

计算公式

1.实验流程

显微镜、细菌计数板

菌体本身

计数方便、操作简单

死菌、活菌都计算在内

每毫升原液含菌数＝每小格平均培养基

培养基上菌落数

计数的是活菌

操作较复杂，有一定误差

每毫升原液含菌数＝培养基上平菌体数×400×10 000×稀释倍数

均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积

稀释度

1 菌落数/平板

菌数/克土壤

2

3

104

平均值

1

2

105

3

平均值

1

2

106

3

平均值

2．实验设计原则

(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作重复组，以增强实验结果的说服力与准确性。

(2)设立两种对照组：

①判断培养基中是否有杂菌污染，需同时将未接种的选择培养基进行培养。

②判断选择培养基是否具有筛选作用，需同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。

3．结果分析与评价

内容

有无杂菌污染

的判断

选择培养基的筛选作用

样品的稀释操作

重复组的结果

现象

对照的培养皿中无菌落生长

培养基中菌落数偏高

菌落形态多样，菌落数偏高

牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目

得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板

结论

未被杂菌污染

被杂菌污染

培养基中混入其他氮源

选择培养基具有筛选作用

操作成功

若选取同一种土样，统计结果应接近