课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计方案

血红蛋白的提取与分离

一．教学目标：

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

二．教学重点和难点

课题重点：

凝胶色谱法的原理和方法。

课题难点：

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

三、学习过程

A、自主学习

(一)、基础知识

一、凝胶色谱法

1. 概念：也称做____________；是根据___________________分离蛋白质的有效方法。

2. 原理：(1)由____________构成的凝胶，内部有许多贯穿的的______。⑵当______________不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量______的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程______，移动速度______，而相对分子质量_______的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在______移动，路程______，移动速度______，从而使_____________不同的蛋白质分子得以分离。

三、电泳

1. 概念：指_________在电场的作用下发生______的过程。

2. 原理：在一定的_____下，_____、______等生物大分子的可解离基团会带上______或_____在______的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_______的电极移动。

3. 作用：电泳利用了待分离样品中各种分子

的差异及分子本身的_________、____________ 的不同，使带电分子产生不同的_________，从而实现样品中__________的分离。

4. 方法：常用的电泳方法有________________ 和____________________。测定蛋白质分子量时通常使用__________________________。

四、实验操作

1、样品处理:

通过___________、________ _______、______等操作收集血红蛋白溶液。

(1) 红细胞的洗涤：目的是___________。分离时采取_______________，直至上清液中

没有______，表明红细胞已洗涤干净。

(2) 血红蛋白的释放：在_______和______ 的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。

(3) 分离血红蛋白溶液：把_______离心后，将试管中的液体用______过滤、除去

___________，于_________中静置片刻后，分离出下层的_____________。

2、粗分离：即透析

(1)方法：将血红蛋白溶液装入_________ 将________放入一定量适宜浓度的

____________中，透析______。

(2)目的：将____________的杂质除去。

(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。

3. 纯化: 通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：

(1) 凝胶色谱柱的制作。

(2) 凝胶色谱柱的装填

①

材料：本实验使用的是______________

②

方法：凝胶用_______充分溶胀后。配成___________，一次性______倒人色谱柱内。不能有______存在；不能发生________流干，露出凝胶颗粒的现象。

(3) 样品的加入和洗脱

①a、准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的________缓慢下降到与________平齐，关闭出口。

b、加样：用______小心地将1mL透析后的样品加到________的顶端，注意不要破坏________。

c、加样后：打开下端出口，使样品渗入__________内。

②洗脱：加入______________________，打开下端出口，进行______。

4、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是__________________________。

五、操作提示

1、红细胞的洗涤：_________、_________与_________十分重要。_________过少，无法除去血浆蛋白；_________过高和______过长会使_______等一同沉淀，达不到分离效果。

2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在_______中膨胀，可以将加入其中的_______用_________加热，加速膨胀。

3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的________，降低_________。

4、蛋白质的分离：如果红色区带__________地移动，说明色谱柱制作成功。

B．重点、难点突破

⑴

是否完成对血液样品的处理

观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

⑵

凝胶色谱柱的装填是否成功。

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

⑶

血红蛋白的分离是否成功

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

⑷

你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？

答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子

后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

【思路点拨】

根据等电点不同，可以利用电泳法将特定的蛋白质分离出来。