课题3　血红蛋白的提取和分离优秀教学设计

一、蛋白质提取、分离（阅读教材P64～66）

1．蛋白质分离的理论依据

2．凝胶色谱法(分配色谱法) (1)概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

(2)分离原理

相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

3．缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界酸和碱对溶液pH的影响，维持

pH基本不变。

(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内的缓冲液。

4．电泳

(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

(2)原理

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。

②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

二、血红蛋白的提取和分离（阅读教材P66～70）

1．样品处理

(1)红细胞的洗涤

①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

②过程：分离(低速短时间离心)→用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆→下层暗红色的红细胞用生理盐水洗涤(如此重复三次)。

(2)血红蛋白的释放

①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。

②过程

(3)分离血红蛋白溶液：离心(以2 000 r/min速度，离心10 min)→观察到离心管中的溶液分为4层，从上往下依次为：

第1层：无色透明的甲苯层。

第2层：脂溶性物质的沉淀层——白色薄层固体。

第3层：血红蛋白的水溶液——红色透明液体。

第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。

将液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

2．透析——粗分离

过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量－浓度为20 mmol·L1的磷酸缓冲液中(pH＝7.0)，透析12 h。

3．纯化——凝胶色谱操作

制作凝胶色谱柱―→装填凝胶色谱柱―→样品的加入和洗脱。

4．纯度鉴定

鉴定方法中使用最多的是

SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

[共研探究] 生物体内的蛋白质多种多样，分离蛋白质常使用的方法是凝胶色谱法和电泳法，都是根据不同蛋白质分子之间的差异来分离的。

1．凝胶色谱法

(1)分离蛋白质的过程(如图B) ①蛋白质混合物上柱。

②洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于凝胶颗粒之外。

③相对分子质量较小的蛋白质被滞留；相对分子质量较大的蛋白质向下移动。

④相对分子质量不同的分子完全分开。

⑤相对分子质量较大的蛋白质已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中。

(2)凝胶色谱法的原理

直径大小

运动方式

运动路程

运动速度

洗脱次序

相对分子质量大

较大

垂直向下运动

较短

较快

先流出

相对分子质量小

较小

无规则的扩散运动

较长

较慢

后流出

2.缓冲溶液

(1)概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变的溶液。

(2)缓冲溶液的配制：缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

3．电泳

(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

(2)原理：在同一电场下，由于各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)常用方法

①琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖本身不带电荷，由于各种分子带电性质、分子大小和形状的不同，在电场中迁移速率不同，从而得以分离。

②聚丙烯酰胺凝胶电泳

a．SDS：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链；

b．SDS能与各种蛋白质结合形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

[总结升华] 凝胶色谱法和电泳法的比较

分离依据

分离动力

分子大小

的影响

[对点演练] 1．使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为(

) 凝胶色谱法

相对分子质量大小

重力

相对分子质量大，移动速度快

电泳

分子带电性质差异、分子大

小和形状等

电场力

分子大，阻力大，移动速度慢

解析：选B

凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分

离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。

2．下列关于电泳的叙述，不正确的是(

) A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少

D．用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小

解析：选C

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，使电泳迁移率完全取决于蛋白质分子的大小。

[共研探究] 每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质不同会有很大差异，下面以哺乳动物红细胞为材料，学习初步分离血红蛋白的方法。

1．样品处理和粗分离

(1)红细胞的洗涤：采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

根据上述内容，回答下列问题：

①选用哺乳动物的成熟红细胞作实验材料，因为其没有细胞核和众多细胞器，血红蛋白为有色蛋白。

②洗涤红细胞不能用蒸馏水代替生理盐水，因为生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定。而且洗涤次数不能过少，否则无法去除血浆蛋白；离心速度过高或离心时间过长，白细胞、淋巴细胞一同沉淀。

(2)血红蛋白的释放

将洗涤好的红细胞倒入烧杯中：

①加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破。

②加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜。

③置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min，其作用是加速红细胞破裂。

④红细胞破裂，释放出血红蛋白。

(3)分离血红蛋白溶液

①分离过程

混合液―→离心管――→溶液分层―→离心管中液体

――→

除去脂溶性沉淀层―→分10 min过滤液漏斗――→分出下层的红色透明液体(血红蛋白溶液) ②离心管中溶液分层示意图

静置2 000 r/min滤纸

(4)透析

①目的：a.除去样品中相对分子质量较小的杂质。

b．用于更换样品的缓冲液。

②原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

③过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。

2．凝胶色谱操作

(1)凝胶色谱柱的制作

①取长40 cm，内径1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②柱底部制作：选择适合的橡皮塞→橡皮塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。

③柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。

④将上述三部分按相应位置组装成一个整体。

(2)凝胶色谱柱的装填

计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量

↓

凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液

↓

固定：将色谱柱垂直固定在支架上

↓

装填：将凝胶悬液一次性装填入色谱柱内

↓

洗涤平衡：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密

(3)样品的加入和洗脱

打开流出口，使缓冲液与凝胶面平齐，关闭出口

↓

用吸管将

1_mL样品加到色谱柱顶端，打开出口，使样品进入凝胶层后，关闭出口

↓

小心加入物质的量浓度为

20_mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度后，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，开始洗脱

↓

待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每

5_mL收集一管，连续收集

3．纯度鉴定

判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

[总结升华] 1．血液样品处理后发生的变化

(1)正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。

(2)分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。

(3)红细胞不纯净的原因：离心速度过高或离心时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀。

2．判断装填的凝胶色谱柱是否成功

(1)判断方法：

①在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填均匀。

②加入大分子的有色物质，观察色带移动情况。

(2)成功的标准及调整：

①判断标准：若色带均匀、狭窄、平整，说明性能良好。

②调整方法：若色谱柱内出现纹路，可轻轻敲打柱体以消除，若消除不了则重新装柱。

③色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。

3．血红蛋白分离效果的判断

(1)若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。

(2)若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。

【易错易混】

(1)凝胶色谱柱的直径不宜过大，直径过大，易造成洗脱液体积增大，样品的稀释浓度过大。

(2)在装填凝胶色谱柱时，要注意不得有气泡存在，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；同时在凝胶色谱操作中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生以上现象，凝胶色谱柱必须重新装填。

(3)洗脱液的流速是影响分离效果的重要因素之一，洗脱液应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱柱上的压力恒定。

[对点演练] 3．下列说法不正确的是(

) A．在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变

B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成

C．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

D．透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内

解析：选D

透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。

1．用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质(

) A．路程较长，移动速度较慢

B．路程较长，移动速度较快

C．路程较短，移动速度较慢

D．路程较短，移动速度较快

解析：选D

当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

2．使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于(

) A．电荷的多少

B．分子的大小

C．肽链的多少

D．分子形状的差异

解析：选B

在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳迁移率完全取决于分子的大小。

3．下列关于蛋白质提取和分离实验中样品处理步骤的叙述，正确的是(

) A．红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心

B．血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌

C．分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心，过滤后，用分液漏斗分离

D．透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0 的磷酸缓冲液中透析12 h 解析：选C

红细胞洗涤步骤中应加入生理盐水而不是蒸馏水；血红蛋白释放步骤中应加入蒸馏水而不是生理盐水；透析时缓冲液pH应为7.0而不是4.0。

4．对蛋白质的研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：

(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：____________、______________、______________和纯度鉴定。

(2)如果要从红细胞中分离出血红蛋白，实验前取新鲜血液时要在采血容器中预先加入柠檬酸钠的目的是____________________。

(3)血红蛋白的提取又可以细分为：红细胞的洗涤、______________、分离血红蛋白溶液和______________。其中分离血红蛋白溶液时需要用到________________(仪器)分出下层红色透明液体。

(4)装填凝胶色谱柱时，要注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡必须重新装。这是因为__________________________________________________________。

(5)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。

①透析的目的是：_____________________________________。

②透析的原理是：________________________________________。

(6)通过凝胶色谱法将样品进一步纯化后，最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

①样品纯化的目的是________________________________________。

②血红蛋白呈现________色。这一颜色特点对进行蛋白质的分离的意义：__________________________________________________________。

解析：(1)蛋白质的提取和分离一般分为样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四个步骤。(2)柠檬酸钠是一种抗凝剂，能够防止血液凝固。(3)血红蛋白的提取可分为红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液和透析。其中分离血红蛋白溶液时要用分液漏斗分出下层红色透明液体。(4)凝胶色谱柱内产生的气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。(5)收集的血红蛋白溶液在透析袋中进行透析，目的是去除分子量较小的杂质；原理是透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内。(6)利用凝胶色谱法进行纯化，目的是将相对分子质量较大的杂质蛋白质去除；血红蛋白是有色蛋白，呈现红色，利用凝胶色谱法分离时，可通过直接观察颜色来判断收集洗脱液的时期。

答案：(1)样品处理

粗分离

纯化

(2)防止血液凝固

(3)血红蛋白的释放

透析

分液漏斗

(4)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果

(5)①去除分子量较小的杂质

②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内

(6)①将相对分子质量大的杂质蛋白除去

②红

在用凝胶色谱法分离血红蛋白时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时期，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了操作。