课题3　血红蛋白的提取和分离优秀教学设计

生物选修1教案专题5DNA和蛋白质技术

课题2

血红蛋白的提取和分离

教学目标

1．尝试血液中血红蛋白的提取和分离。 2．了解色谱法、电泳法的基本原理。 教学重点和难点

1．教学重点：凝胶色谱法的原理和方法。 2．教学难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱填料的装填。 教学过程

导入：蛋白质是生命活动中不可缺少的物质。对蛋白质的研究和应用必须提取和分离高纯度的蛋白质。本课题我们以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一般技术。

一、基础知识

（一）凝胶色谱法：

1．

原理：大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；

小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。

2．

材料：多孔性的多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

3．

分离过程：图示

（二）缓冲溶液：

1．组成：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸钠，NaH2PO4/Na2HPO4等

2．

配制：调节缓冲剂的比例，可配制不同pH的缓冲液

3．作用：抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。

（三）电泳

1．概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

2．原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

3．方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

4．过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

二、实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白释放；离心分离等操作收集到的血红蛋白溶液。

（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。

（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。

（4）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。

（一）样品处理

1

生物选修1教案专题5DNA和蛋白质技术

1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。重复洗涤3次，直至上清液没有黄色。

2、血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯

，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。

3、

分离血红蛋白溶液：①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。

（二）凝胶色谱的制作

1．凝胶色谱柱的制作：

①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。

2．凝胶色谱柱的装填

①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。

②凝胶的前处理：配制凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。

2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、洗脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

3.样品加入与洗脱

①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。

⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。

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