课题3　血红蛋白的提取和分离教案板书设计

课题三

血红蛋白的提取和分离

教学目标

了解

从复杂体系中提取生物大分子的

基本过程和方法

理解

凝胶色谱法的原理和方法

教学重难点

1.凝胶色谱法的原理和方法

2.样品的预处理、色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

课前预习学案

一、凝胶色谱法

1．概念

也称作

法，是根据

的大小分离蛋白质的有效方法，凝胶实际上是一些微小的

球体。

2．原理

(1)凝胶的基本知识：

形态：微小的

凝胶组成：大多数由

构成结构：内部有许多

(2)分离原理：相对分子质量较小的蛋白质容易进

入

的通道，路程

，移动速度较慢；

的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程

，移动速度较快。

二、缓冲溶液

1．作用

在一定范围内，缓冲溶液能抵制

对溶液pH的影响，维持

基本不变。

2．配制

通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，调节缓冲剂

的

就可以制得在

范围内的缓冲液。

三、电泳

1．概念

带电粒子在

的作用下发生

的过程。

2．原理

(1)许多重要的生物大分子，如

、

等都具

有

的基团，在一定的pH下，这些基团会

带上

或

。

(2)在电场的作用下，这些带电分子会向着

移动。

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(3)电泳利用了待分离样品中各种分子

以及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生不同的

，从而实现样品中各种分子的分离。

四、血红蛋白提取和分离

1．样品处理及粗分离

(1)红细胞的洗涤：目的是去除

。

(2)红细胞的释放：在

和

作用下，借助磁力搅拌器的

作用，红细胞破裂释放出血红蛋白。

(3)分离血红蛋白溶液：离心(以2 000 r/min速度，离心10 min)→观察到试管中的溶液分4层，从上往下依次为：

第1层：

的甲苯层。

第2层：

的沉淀层——

薄层固体。

第3层：

的水溶液——

透明液体。

第4层：其他杂质的

色沉淀物。

将液体用

过滤，除去

，于

中静置片刻后，分出下层的

液体。

(4)透析——粗分离。

①过程：取1 mL的

溶液装入

中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol·L－1 的

中(pH＝

)，透析12 h。

②原理：透析袋能使

自由进出，而将

保留在袋内。

③目的：去除

。

2．凝胶色谱操作——纯化

(1)

的制作。

(2)凝胶色谱柱的装填：

①装柱前要将色谱柱

在支架上。

②装柱前需根据色谱柱的

计算所需要的

。

③注意色谱柱内不能有

存在，否则重装。

(3)样品的

和

：

在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况，如果血红蛋白的红色区带

地移

动，说明色谱柱制作成功。

3．纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

判断

的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定方法中使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

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答案和提示

（一）旁栏思考题

你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？

答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

（二）练习

1．答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。

2．答：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。

缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。

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3．答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

4．答：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

5．答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

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课内探究学案

1．读教材P64～66[基础知识]的相关内容，归纳并回答下列问题。

(1)观察教材P65图5－13，试从物质大小、运动方式、路程、速度等

方面填写下表，以分析总结凝胶色谱法的原理。

相对分子质量大

相对分子质量小

直径大小

运动方式

运动路程

运动速度

洗脱次序

1________ □3____________ □较短

5________ □先流出

2________ □无规则的扩散运动

4________ □较慢

6____________ □(2)交流并分析为什么使用缓冲液？

(3)为什么电泳能够将不同蛋白质得以分离？

(4)试分析在琼脂糖凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳中，决定各种分子在电场中的迁移速度的因素分别是什么？

2．读教材P66－69[实验操作]相关内容，归纳并回答下列问题：

(1)从实验现象观察的角度分析选用哺乳动物的红细胞作为实验材料的原因？

(2)运用文字和箭头表示出血红蛋白提取和分离的实验流程。

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(3)血红蛋白的提取和分离中，将分离出的血红蛋白液进行透析的目的什么？

(4)根据哪些指标来判断凝胶色谱柱装填成功？

对蛋白质的研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：

(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：______________、________________、________________和纯度鉴定。

(2)如果要从红细胞中分离出血红蛋白，实验前取新鲜血液要在采血容器中预先加入柠檬酸钠的目的是________________。

(3)血红蛋白的提取又可以细分为：红细胞的洗涤、________________、分离血红蛋白溶液和________________。其中分离血红蛋白溶液时需要用到________________(仪器)分出下层红色透明液体。

(4)装填凝胶色谱柱时，要注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡必须重新装。这是因为__________________________________。

(5)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。

①透析的目的是__________________________________。

②透析的原理是__________________________________。

(6)通过凝胶色谱法将样品进一步纯化后，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

①样品纯化的目的是_____________________________。

②血红蛋白的特点是_____________________________。这一特点对进行蛋白质的分离的___________________________________________________。

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综合

归纳

迁移

拓展

蛋白质提取和分离过程中杂质蛋白的去除措施

(1)透析：去除相对分子质量较小的蛋白质；

(2)凝胶色谱法：去除相对分子质量较大的杂质蛋白质。

课时知识小结

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