课题3　血红蛋白的提取和分离名师教学设计1

课题

血红蛋白

的提取和分离

一、[课题目标]

(一)知识与技能

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

(二)情感、态度与价值观

初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神

(三)过程与方法

体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求

二、[课题重点]

凝胶色谱法的原理和方法

三、[课题难点]

样品的预处理:色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

四、[教学方法]

启发式教学

五

、[教学工具]

多媒体课件

六、[教学过程] 1.基础知识

蛋白质的物化理性质:形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种质。

1.1凝胶色谱法(分配色谱法): (1)原理: 分子量大的分子通过多孔凝胶额粒的间隙，路程短，流动快:分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

(2)凝胶材料:多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

(3)分离过程: 混合物上柱- +洗脱→大分子流动快、小分子流动慢- +收集大分子一收集小分子*洗脱:从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

1.2缓冲溶液

(1)原理:由弱酸和相应的强贼弱酸盐组成，

调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

(2)缓冲液作用:抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

1.3凝胶电泳法: (1)原理:不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

(2)分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。

(3)分离过程:在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电:加入带负电荷多的SDS，

形成“蛋白质一SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

2.实验设计

2.1蛋白质的提取和分离- -般分为哪些基本步骤?样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

2.2选择实验材料

2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为:洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么? 除去d浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。

红细胞的洗涤过程为

血液+柠檬酸钠一低速短时离心→吸出上层血浆-红细胞+5倍体积生理盐水一缓慢搅拌10min→低速短时离心一吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

2.4如何除去无机盐离子和小分子有机物质呢?。

透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH=7的磷酸缓冲液中。思考:为何使用pH=7的磷酸缓冲液?为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量?维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。

总结:通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子(如呼吸酶等)。怎样将杂蛋白与血红蛋白分高开来呢?我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤--粗分离(凝胶色谱操作)。

2.5凝胶色谱分离蛋白质包括:制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。根据教材图5一19，说出制作色谱柱需要的材料。

橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。色谱生的制作过程:准备材料-加工橡皮塞-安装色谱柱下面进行第二步--凝胶色谱柱的装填。请阅读教材: 色谱性的装填过程。

样品加入和洗脱。其基本过程是: 调节缓冲液面-*加入蛋白质样品一调节缓冲液面*洗脱.+收集分装蛋白质至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项: (1)红细胞的洗涤:洗涤次数不能过少:低速、短时离心。

(2)凝胶的预处理! 沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡

(3)色谱柱的装填:装填尽量紧密，降低颗粒间隙:无气泡:洗脱液不能断流。

(三)课堂总结