复习与测试课程导入

微生物的培养和分离

1．大肠杆菌

(1)特性：大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧(代谢类型)的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但若进入人的泌尿系统，就会对人体产生危害。

(2)用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。

2．细菌的培养和分离

(1)细菌的繁殖：以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20 min分裂一次。

(2)培养的方法：需要将已有细菌的培养物转移到新的培养基中，一般用接种环(工具)转移带菌的培养物。

(3)细菌分离的方法与特点

分离方法

划线分离法

涂布分离法

3.大肠杆菌的培养和分离实验

(1)实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。

(2)实验步骤

培养基灭菌

50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基及培养皿高压蒸

倒平板

接种

划线分离

培养观察

(3)大肠杆菌分离的用途：单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。

- 1 - 特点

操作简单

操作复杂，单菌落更易分开

汽灭菌

将培养基分别倒至4个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面

在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养12 h 用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿

培养皿倒置(盖在下面)，放在37 ℃恒温培养箱中培养12～24 h后，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落

4．微生物两种常用的接种方法比较

比较

工具

划线分离法

接种环

通过接种环在琼脂固体培养基表面连涂布分离法

玻璃刮刀

将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表原理

分散到培养基表面。在数次划线后培面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，来的肉眼可见的细胞群体，即菌落

特点

目的

思考讨论

1．连线无菌技术的方法、类型及对象，并总结消毒与灭菌的区别。

方法简单，但不适宜计数

从而能在培养基表面形成单个的菌落

单菌落更易分开，但操作复杂些

使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落

- 2 -

消毒和灭菌的区别

项目

消毒

条件

较为温和的物理或化学方法

强烈的理化因素

结果

仅杀死物体表面或内部一部分对人常用的方法

煮沸消毒法、巴氏消毒法、体有害的微生物(不包括芽孢和孢子) 紫外线或化学药物消毒法

杀死物体内外所有的微生物，包括芽灼烧灭菌、干热灭菌、高孢和孢子

压蒸汽灭菌

灭菌

2.观察甲、乙、丙、丁四幅图，熟悉倒平板的操作流程，请填空：

(1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。

(2)甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。

(3)丁中的操作需要等待平板冷却凝固才能进行。

3．下图中甲为划线分离法中最重要的环节，乙为操作的结果：

(1)每一次划线后都要将接种环灼烧(

√

) (2)除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端(

×

) 提示

平板划线时除第一次划线外，每一次划线的起点都是上一次划线的末端，而不是第一次划线的末端。

(3)说明乙图划线结束后，培养皿要倒置(盖在下面)在37 ℃恒温培养箱中培养的原因是什么？

提示

平板冷凝后倒置培养，使培养基表面的水分更好地挥发；防止皿盖上的水珠落入培养基中造成污染。

4．如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请思考：

(1)获得图A效果和B效果的接种方法分别是什么？

提示

获得效果A的接种方法为涂布分离法，获得效果B的接种方法为划线分离法。

(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？

提示

最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的

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措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。

1．(2017·杭州一模)据报道，一些企业生产的速冻食品中检出金黄色葡萄球菌超标，加上熟卤制品的大肠杆菌超标，“细菌门”事件引起公众普遍关注。金黄色葡萄球菌能分解卵黄中的卵磷脂，在含卵黄的固体培养基上形成的菌落周围会出现特有的乳白色的乳浊环。请回答下列问题：

(1)某生物兴趣小组欲检测某果汁类食品中是否含有金黄色葡萄球菌以及该菌的含量。

①配制培养基：称取适量的牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂等，加入蒸馏水，搅拌加热至完全溶解后____________，分装到锥形瓶后利用________________进行灭菌，在无菌状态下加入卵黄液(100 mL 10%灭菌NaCl溶液中加一个鸡蛋黄，振荡均匀)摇匀后立即倒平板。

②接种：该小组采用涂布分离法检测果汁样品中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是__________________________；然后，将1 mL果汁样品稀释10倍，在3个平板上用涂布分离法分别接入0.1 mL稀释液。

③培养及结果：将培养皿____________放入恒温培养箱中经适当培养，3个平板上的菌落数分别为19、18和17。据此可得出每升果汁样品中的活菌数为__________个。

(2)示意图A和B中____________表示的是用涂布分离法接种培养后得到的结果。

(3)下列有关常用涂布分离法的操作正确的是________。

A．在超净工作台中进行接种时应关闭紫外灯

B．接种前需先稀释，然后过滤除去杂菌

C．在每个固体培养基表面都可形成单菌落

D．玻璃刮刀浸泡在70%的酒精中灭菌，不用灼烧

(4)菌种保存：在无菌条件下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在________上，在37 ℃下培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。

答案

(1)①调节pH

高压蒸汽灭菌锅

②检测培养基平板灭菌是否合格

③倒置

1.8×106

(2)B

(3)A

(4)斜面

解析

(1)①培养基配制好后应调节酸碱度(pH)，分装到锥形瓶后利用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。②涂布接种前，将制好的空白平板先培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格；③接种后，培养皿需要倒置培养，防止皿盖上凝集的水滴滴落造成污染；0.1 mL稀释液(稀释10倍)含细菌数约为18个，得出每升果汁含有活菌数1.8×106个。(2)图中A为划线分离得到的结果，B为涂布分离得到的结果。(3)在超净工作台进行接种操作时应关闭紫外灯，A正

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确；涂布分离前需稀释，但不能过滤除菌，B错误；稀释度较大的溶液涂布分离不一定出现菌落，C错误；玻璃刮刀浸泡后需要灼烧，D错误。(4)纯化的菌种保存在斜面上。

2．下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程，请回答下列问题：

A.配制培养基―→B.灭菌―→C.扩大培养液体培养基―→

D.划线分离和培养固体培养基―→E.菌种保存

(1)A过程配制的是通用细菌培养基，称为____________培养基。配制时除了加入特定的营养物质以外，还要加入一定量的氯化钠，以维持一定的__________________。对培养基酸碱度的调节，应该在B过程的________(填“前面”或“后面”)。

(2)D过程与C过程相比，培养基中增加的物质是____________，E过程所需的温度是_______。

(3)D过程后，一个菌体便会形成一个______________，这种分离方法是____________的通用方法，也是筛选特定菌株的最简便方法之一。

(4)植物组织培养时，先配制MS培养基，再加入一定比例的植物激素，当生长素相对较多时，可促进________________________________________________________________________。

(5)植物组织培养和微生物培养都需要无菌操作，下列不适宜用高压蒸汽灭菌的是(

) A．接种环和镊子

B．三角瓶和广口瓶

C．发芽培养基和生根培养基

D．用于培养的幼茎和幼芽

答案

(1)LB液体

渗透压

前面

(2)琼脂

4 ℃

(3)(单)菌落

消除污染杂菌(或纯化菌种)

(4)生根

(5)D 解析

(1)LB液体培养基是通用的细菌培养基，LB固体平面培养基则用于划线分离形成单菌落。氯化钠的作用是维持培养基的渗透压。调节好酸碱度后才能进行灭菌，若灭菌后再进行酸碱度调节，又会产生新的污染。(2)在液体培养基的基础上加入一定量的琼脂可形成固体培养基。菌种应置于4 °C冰箱中保存。(3)通过划线分离后，一个菌体就会繁殖出一个菌落。(4)植物组织培养中生长素相对较多时，有利于生根，而细胞分裂素相对较多时，则有利于生芽。(5)高压蒸汽灭菌常用于培养基、培养器材等的灭菌，而用于培养的幼茎和幼芽则不能进行任何灭菌操作，否则会导致细胞死亡。

3．(2017·嘉兴期末)下列是有关大肠杆菌的培养实验，请回答问题：

(1)配制培养大肠杆菌的培养基时，根据“细菌喜荤，霉菌喜素”的规律，通常在培养基中加入蛋白胨和__________作为营养物质，为维持一定的渗透压，常需加入一定量的________________。

(2)大肠杆菌培养和分离的实验中，在____________中进行扩大培养，培养液经________后，在LB固体培养基上进行________，并将培养皿____________放在恒温培养箱中培养，可以获

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得如图效果。为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及________________，应同时将未接种的培养基放入相同条件的恒温培养箱培养。

(3)通常对获得的纯菌种可以依据________的形状、大小等特征进行初步的鉴定。

(4)下列关于“大肠杆菌培养和分离”的操作中，叙述正确的是(

) A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖

B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上

C．为了防止污染，接种工具经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落

D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上

答案

(1)酵母提取物

NaCl

(2)LB液体培养基

稀释

分离

倒置

无菌操作是否规范

(3)菌落

(4)D 解析

(1)配制培养大肠杆菌的培养基时，根据“细菌喜荤，霉菌喜素”的规律，通常在培养基中加入蛋白胨和酵母提取物作为营养物质，为维持一定的渗透压，常需加入一定量的NaCl。(2)大肠杆菌培养和分离的实验中，在LB液体培养基中进行扩大培养，培养液经稀释后，在LB固体培养基上进行分离，并将培养皿倒置放在恒温培养箱中培养；为了检测接种、培养过程是否受杂菌污染以及无菌操作是否规范，应同时将未接种的培养基放入恒温培养箱培养。(3)通常对获得的纯菌种可以依据菌落的形状、大小等特征进行初步的鉴定。(4)高压灭菌加热结束，等待压力表指针回到零后，才能开启锅盖，不能直接打开放气阀使压力表指针回到零，A错误；倒平板过程中不能打开培养皿的皿盖，以防止杂菌污染，B错误；接种环在火焰上灼烧后，待冷却后才可以快速挑取菌落，C错误；用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上，D正确。

培养基的成分和类型

(1)培养基成分：一般都含有水、碳源、氮源、无机盐、生长因子等，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。

(2)培养基的类型及其应用

划分标准

培养基种类

液体培养基

物理性质

半固体培养基

加凝固剂，如琼脂

特点

不加凝固剂

用途

工业生产

观察微生物的运动及微生物的分类、鉴定

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固体培养基

加凝固剂，如琼脂

培养基中加入某种化学物微生物的分离、鉴定及活菌计数

选择培养基

目的用途

质，以抑制不需要的微生物的生长、促进所需要的微生物的生长

根据微生物的代谢特点，在特定微生物的培养、分离

鉴别培养基

培养基中加入某种指示剂或化学药品

不同种类的微生物的鉴别

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