复习与测试优质课教案设计

微生物的培养与应用

复习与测试

1．为了调查某市自来水水源地的水质情况，某研究小组对该地自来水水样中的大肠杆菌进行了测定，请回答下列问题

(1)该小组采用平板划线法分离提纯水样中的细菌，若划线时在培养基上共划了_____个区域，则需要5次灼烧接种环。在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是____________________________。

(2)将1mL水样稀释1000倍，在3个平板上用涂布法分别接入__________M L稀释液，经适宜条件下培养后，3个平板上的菌落数分别为51、50和49。据此可得出每升水样中的活菌数为5.0×10。该过程中还应该同时在另一平板上接种等量无菌水，该处理的目的是____________________________。

(3)菌种需临时保藏时，要先将菌种接种到试管的_______________培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃冰箱中保藏，但此方法存在的缺点是_________。

2．大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一类细菌，含有2000种以上的蛋白质；大肠杆菌的数量是检测自来水是否受粪便污染的最直接的指标。

回答下列问题：

(1)利用凝胶色谱法分离提取到的部分大肠杆菌蛋白质时，等样品完全进入凝胶层后，加入pH为7.0、浓度为20mmol/L的_____到适当高度进行洗脱，结果甲蛋白质先洗脱出来，乙蛋白质后洗脱出来，则相对分子质量较大的是_____。

(2)通过滤膜法可以测定自来水中大肠杆菌的数目：一定体积的自来水样过滤后，将滤膜放在伊红-美蓝培养基（主要成分包括：蛋白胨、NaCl、琼脂、乳糖、伊红-美蓝水溶液）上培养，大肠杆菌的代谢产物能与伊红-美蓝反应，使菌落呈黑色。根据培养基上菌落的数目，计算出大肠杆菌的数量。

①伊红-美蓝培养基属于_____ (填“选择”或“鉴别”)培养基，蛋白胨的作用有_____ (答出两点即可）。

②培养大肠杆菌时，在接种前通常需要检测固体培养基是否被污染，检测方法是_____。

③用滤膜法进行测定时，滤膜的孔径应 _____ (填“大于”或“小于”）大肠杆菌。滤膜法是根据培养基上菌落的数目来推测样品中的活菌数，其原理是________。

3．青霉素酰化酶，又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。该酶主要从大肠埃希菌胞内酶和巨大芽孢杆菌胞外酶中获得，该酶已大规模应用于工业生产头孢类抗生素。某制药厂致力开发新产品，生产头孢类抗生素药物。欲通过人工诱变的方法获得高产青霉素酰化酶的微生物，制备并固定化青霉素酰化酶。根据相关信息回答问题：

试卷第1页，总5页

8

（1）在获得髙产青霉素酰化酶的微生物时，从理论上分析选择对______进行诱变处理后，筛选出的髙产菌株更有利于生产，原因是______，而菌体可以继续进行发酵培养。

（2）在研究中发现，髙产菌株会产生多种分子量不同的酶，且均不会被RNA酶降解。在分离纯化青霉素酰化酶时，适合采用______法；之后需要对其纯度进一步鉴定，使用最多的方法是______。

（3）除显微镜直接计数法外，还常用______法进行活菌计数，其原理是______。为防止人员感染和污染环境，实验人员离开实验室时，一定要做的事情是______。

4．某个实验小组对微生物的培养和五种香辛料提取的精油（编号为A、B、C、D、E）的抑菌能力进行了研究。首先制备了直径为8.5 mm的圆滤纸片若干，灭菌后分别放入各组精油中浸泡2 h。然后取各种待测菌悬液0.15 mL分别在相应的固体培养基上均匀涂布，制成含菌平板。再取浸泡过精油的滤纸片贴在含菌平板上，每个培养皿贴浸过同一种精油的滤纸3片，放培养箱中培养一定时间。测定抑菌圈直径，结果取三次重复实验的平均值，其数据如表所示，请回答下列问题：

精油种类

A 抑菌圈直径（mm）

菌种

大肠杆菌

白葡萄球菌

黑曲霉

青霉

（1）不同微生物培养时对pH的要求往往不同，培养霉菌的培养基的pH值往往__（填“高于”“低于”或“等于”）培养细菌的pH值。在特定条件下，根据不同微生物在固体培养基上形成的菌落的__（答出2项即可）等特征可以区分不同的微生物。

（2）腐乳制作时，需要添加香辛料，其作用有__。

（3）本实验中采用了__法接种。据表可知不同精油对不同种类的微生物杀伤作用不同，C和E对细菌的杀伤作用__（填“大于”或“小于”）对真菌的杀伤作用。

（4）有同学认为缺少是否抗病毒的实验结果，提出在营养琼脂培养基上接种常见的病毒进行实验。你认为可以吗？__为什么？__。

试卷第2页，总5页

B C D E 21.1 14.7 24.6 25.3 26.0 22.0 33.0 38.2 15.1 19.1 26.0 24.3 24.0 12.0 24.5 25.1 23.2 29.1 49.6 42.8

5．将普通大麦经过一系列处理，最终可以得到麦芽汁浸出液。在麦芽汁浸出液中加入一定量蛋白胨、葡萄糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：

（1）M培养基若用于某真菌的筛选，则培养基中应加入四环素以抑制_______的生长，加入了四环素的培养基属于__________培养基。

（2）M培养基为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除碳源外还有__________。碳源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有______（答出两点即可）。

（3）从得到的上述真菌中分离、纯化某特定的酶，常用的方法是电泳法和凝胶色谱法。电泳法分离酶，影响电泳速度的因素有____________（答出两点即可）。凝胶色谱法最先分离出来的是分子量____________（填“大”或

“小”）的酶分子，原因是_______________。

（4）酶的活性指酶催化一定化学反应的能力，酶反应速度指________________。

6．果胶酶的应用领域非常广泛，它存在于各种微生物中。为获得土壤中果胶酶高产菌株，科研人员进行了下列分离、筛选、鉴定和酶的工业生产等工作。

（1）实验过程中，科研人员配制了下表所示成分的培养基，该表空白处的两种成分是:A______、B_______。用此配方进行选择培养，目的是__________________________ 。

成分

添加量

（2）为在培养基表面形成单个菌落，以接种环为工具，则用______法进行接种。灼烧接种环之后，要等冷却才可继续操作，理由是：_____________。

（3）完善“探究果胶酶的最适用量”的实验方案：向分别盛有1.0、1.5、2.0……4.0mL2%果胶酶溶液的一组试管内同时加入5mL苹果泥，__________________________，适温水浴30分钟后，过滤每支试管的反应液，比较滤出的果汁体积或_____________________。

（4）当果胶酶与苹果泥混合在一起时，酶很难回收，不能再次利用，还可能影响了产品的质量。科研人员认为引进_______________技术，可解决生产中遇到的这些问题了。

7．乳酸杆菌是人体有益的微生物之一，常用于生产酸奶，其发酵产物为乳酸，能溶解周围环境中的难溶性碳酸钙。回答下列问题：

(1)为检测某品牌酸奶中的乳酸杆菌含量是否达标，检验人员进行了相关实验。

①配置培养基：培养基中除含水、无机盐、碳源、氮源和琼脂外，还需添加维生素和___________。

②稀释样品：取1mL待测酸奶，用___________进行梯度稀释。

试卷第3页，总5页

K2HPO4

0.1g MgSO4

0.5g NaNO3

3g FeSO4

0.01g A 2g 琼脂

15g B 定容至1L

③接种培养：用___________法接种，培养时控制的气体条件是___________。

④观察计数：菌落周围出现的______就是乳酸杆菌的菌落，选择菌落数在___________的平板计数。每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，目的是___________。

(2)生产上不能用含有抗生素的牛奶发酵成酸奶，原因是_____。

8．破伤风芽孢杆菌可产生明胶酶，能将明胶（温度低于24℃时呈固态，大于等于24℃时液化）分解，使其失去凝固能力而液化。为验证破伤风芽孢杆菌能产生明胶酶，某同学将破伤风芽孢杆菌穿刺接种于明胶培养基中培养。回答下列问题：

（1）破伤风芽孢杆菌与不能产生明胶酶的细菌相比，能产生明胶酶的原因是______________ 。

（2）在结构上破伤风芽孢杆菌与酵母菌相比的主要区别是____________________。在培养破伤风芽孢杆菌时需要严格控制氧气条件，理由是____________________ 。

（3）接种了破伤风芽孢杆菌的培养基应置于______________℃（选填“20”、“30”或“40”）恒温箱中培养，一段时间后_____________________________________ 。

（4）使用后的培养基丢弃前一定要进行__________灭菌处理。在微生物培养过程中，采用无菌技术的目的是___________________、

________________________和避免感染操作者。

9．酸奶中乳酸活菌数的含量是衡量酸奶营养价值的一个重要指标。某兴趣小组拟探究一定体积牛奶发酵液生产酸奶过程中乳酸活菌数的变化规律。如表是某兴趣小组测定的一定体积牛奶发酵液在0.5～5.0小时内发酵液中pH值和活菌数的数值，请根据实验和表格回答下列问题：

活菌数（10个发酵时间（h）

pH /ml）

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 6.08 1.5 5.80 4.5 5.54 5.0 5.15 26 4.75 101.5 4.67 72.5 7试卷第4页，总5页

3.5 4.0 4.5 5.0

4.54 91.5 4.45 a 4.35 51 4.28 45 （1）随着发酵时间延长，单位体积活菌数发生的变化为______，原因是______。

（2）以下为某兴趣小组的实验步骤：

①配置牛奶发酵液，经巴氏消毒法消毒，加入已______的3个发酵瓶中。

②分别向3个发酵瓶中加入含适量等量的乳酸活菌的混合发酵剂。

③在41～43℃发酵，每隔半小时取样，并采用______法接种，培养后计数。

（3）请根据以上实验步骤③继续以下的操作，回答问题：

①接种前现需要制作培养基，培养基中通常含蛋白胨，蛋白胨提供的主要营养有______；培养基灭菌常采用______法。

②若在pH为4.45条件下培养一段时间，统计得到10、10、10三个稀释度的培养基上平均菌落数依次为412个、56个、4个，则表格中的字母a代表的数值为______。

③根据实验结果分析，生产发酵时间______h后，于0～5℃冷藏营养价值较高。

10．枯草芽孢杆菌菌体可合成淀粉酶等消化酶，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，但在紫外线照射下可获得不能合成淀粉酶的突变体。研究发现紫外线处理时间过短，获得突变体不足，若紫外线处理时间过长，又会导致枯草芽孢杆菌大量死亡。为探究紫外线处理最佳时间，需测定经处理后的枯草芽孢杆菌的突变率和存活率。完成相关实验步骤：

（1）从临时保存菌种的___________培养基中挑取菌体，制成菌液，用稀释涂布平板法或_________方法测定枯草芽孢杆菌的浓度；

（2）____________________,分别用同等强度的紫外线灯处理1分钟、3分钟、5分钟；

（3）将每组处理后的菌液稀释适宜倍数，吸取一定量的菌液涂布在1个______________的培养基上，另取等量菌液涂布在1个牛肉膏蛋白胨培养基上。37℃培养48小时。

（4）计算每个平板上菌落数。牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数可用于计算________，其与另一种培养基上的菌落数的差值可用于计算_______________。

（5）为了使上述实验结果更精确可信，请提出一项改正措施____________________。

678试卷第5页，总5页

参考答案

1．4 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，这样可以将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面 0.1 检测培养基平板灭菌是否合格 固体斜面 保存的时间不长,菌种容易被污染或产生变异 【解析】

【分析】

1、微生物常见的接种的方法：①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养，在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。

2、划线分离操作中的有关问题：①在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。

第一次灼烧

目避免接种环上可能存在的

的微生物污染培养基

②在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。③在进行第二次以及其后的划线操作时'要从上一次划线的末端开始划线．每次划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

【详解】

（1）采用平板划线法纯化微生物时，每次划线之前都要灼烧接种环，划线结束后还需灼烧接种环，若划线时在培养基上共划了4个区域，则需要5次灼烧接种环；每次划线前都要灼烧接种环的目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，这样可以将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

（2）在纯化菌种时，所用的培养基都需要在接种前用压蒸汽灭菌法进行灭菌；将1mL水样稀释1000倍，在3个平板上用涂布法分别接入XmL稀释液，经适宜条件下培养后，3个平板上的菌落数分别为51、50和49。

首先求出3个平板的平均菌落数即(51 +50+49)+3=50 ，然后利用公式(CN) xM ，即可得出每升水样中的活菌数= ( 50/X) ×1000×1000=5.0x108 ；每次划线之前灼烧

杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种

划线结束灼烧

杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染或感染操作者

试卷第6页，总9页

可得出X=0.1，要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种无菌水作为对照进行实验，这样做的目的是检测培养基平板灭菌是否合格。

（3）菌种需临时保藏时，要先将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4°C冰箱中保藏。但此方法存在的缺点是保存的时间不长,菌种容易被污染或产生变异。

【点睛】

本题主要考查微生物的保存和微生物的接种方法，意在强化学生对实验室的微生物的培养的相关知识的理解与掌握。

2．磷酸缓冲液 甲蛋白质 鉴别 提供碳源、氮源、维生素 将未接种的培养基在适宜的条件下放置一段时间,观察培养基上是否有菌落出现 小于 (当样品中细菌浓度低时,)培养基表面生长的一个菌落来源于样品中的一个活菌 【解析】

【分析】

凝胶色谱法的原理是：小分子蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，后被洗脱出来；而分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，路程较短、移动速度较快，先被洗脱出来。

【详解】

（1）凝胶色谱法所用洗脱液是磷酸缓冲液。甲蛋白质先洗脱出来，乙蛋白质后洗脱出来，说明甲的相对分子质量较大。

（2）①大肠杆菌的代谢产物能与伊红-美蓝发生特定的颜色反应，使菌落呈黑色，因此可以鉴别大肠杆菌，可知伊红-美蓝培养基属于鉴别培养基。蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成，富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类，因此添加在培养基中主要作为氨源，也可提供碳源和维生素。②检测培养基是否被污染，需在接种前将空白培养基即未接种的培养基放在适宜的条件下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落出现，若有菌落出现，则说明培养基被污染或灭菌不彻底，不能用于接种实验。③滤膜法测定活菌数目的原理是：当样品中细菌浓度低时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品中的一个活菌，滤膜的孔径应小于大肠杆菌。

3．巨大芽孢杆菌 巨大芽孢杆菌产生的青霉素酰胺酶是胞外酶，对发酵液进行分离提纯即可获得青霉素酰化酶 透析和凝胶色谱 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 稀释涂布平板 在稀释度足够高时，培养基表面的一个菌落来源于（稀释液中的）一个活菌 洗手试卷第7页，总9页

或用酒精对双手消毒等、使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理 【解析】

【分析】

1、“一个菌落”是同种细菌的群体，在生态学中属于一个种群。稀释涂布平板法依据的原理是在稀释度足够高的菌液里，将聚集在一起的菌种分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。在进行菌种纯化时，还可以采用平板划线法进行。 2、分离计数微生物的方法：显微镜直接计数法和稀释涂布平板法。 3、分离纯化蛋白质的方法：凝胶色谱法和凝胶电泳法。

【详解】

（1）在获得髙产青霉素酰化酶的微生物时，从理论上分析选择对巨大芽孢杆菌进行诱变处理后，筛选出的髙产菌株更有利于生产，原因是巨大芽孢杆菌产生的青霉素酰胺酶是胞外酶，对发酵液进行分离提纯即可获得青霉素酰化酶，而菌体可以继续进行发酵培养。

（2）在研究中发现，髙产菌株会产生多种分子量不同的酶，且均不会被RNA酶降解。在分离纯化青霉素酰化酶时，适合采用透析和凝胶色谱法；之后需要对其纯度进一步鉴定，使用最多的方法是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 （3）除显微镜直接计数法外，还常用稀释涂布平板法进行活菌计数，其原理是在稀释度足够高时，培养基表面的一个菌落来源于（稀释液中的）一个活菌。为防止人员感染和污染环境，实验人员离开实验室时，一定要做的事情是洗手或用酒精对双手消毒等、使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，防止被细菌感染。

【点睛】

本题综合考查了微生物的培养、分离、纯化的方法步骤等内容，同时考查了学生的识记能力和分析问题的能力，运用所学的知识解决实际问题的能力。

4．低于 形状、大小、隆起程度、颜色 调制风味、防腐杀菌 稀释涂布平板 小于 不可以 病毒为寄生生物，在该培养基上不能生长 【解析】

【分析】

根据表格分析，实验的自变量是精油的种类、菌种，因变量是抑菌圈的大小(直径) ，抑菌圈越大，表示抑菌的效果越好。图中显示不同的精油对不同的细菌抑菌效果不同，其中B精油对大肠杆菌的抑制效果最好，E精油对白葡萄球菌、黑曲霉、青毒的抑制效果最好。

【详解】

试卷第8页，总9页

（1）不同种类的微生物，一般需要不同的培养温度和培养时间，如细菌-般在30~ 37℃的温度下培养|~2d，放线菌一般在25~ 28℃的温度下培养5~7d，霉菌一般在25~ 28℃的温度下培养3 ~ 4d，因此在培养箱中培养时霉菌培养温度低于细菌培养温度，培养时间短于霉菌培养时间。不同微生物菌落的形状、大小、隆起程度、颜色等特征不同，可以作为区分不同的微生物的标准。

（2）在腐乳的制作过程中，加入香辛料的目的是调制风味、防腐杀菌。

（3）本实验对菌种进行了计数，因此接种方法是稀释涂布平板法；根据报告数据分析可知，精油C、E对细菌低于真菌是杀伤力。

（4）由于病毒没有细胞结构，营寄生生活，必须寄生于活细胞中，在该培养基上不能独立生存，因此不能在营养琼脂培养基上接种常见的病毒进行实验。

【点睛】

本题考查腐乳的制作、微生物的培养、微生物的接种方式等相关知识，对于此类试题，需要考生注意的细节较多，如实验的原理、实验采用的方法、实验现象及结论等，需要考生在平时的学习过程中注意积累。

5．细菌 选择 氮源、无机盐 蛋白质、核酸 带电性质的差异，分子本身大小、形状不同 大 相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在外部移动，路程较短，移动速度较快 单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量 【解析】

【分析】

抗生素可抑制细菌的生长。微生物培养的营养成分包括碳源、氮源、水和无机盐。电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，为了消除电荷对迁移率的影响，可在凝胶中加入十二烷基硫酸钠（SDS），SDS可以与各种蛋白质形成蛋白质——SDS复合物，SDS所带负电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质之间的电荷的差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

【详解】

（1）四环素可抑制细菌的生长，而不抑制真菌的生长，所以M培养基若用于某真菌的筛选，则培养基中应加入四环素以抑制细菌的生长，加入了四环素的培养基属于选择培养基。

（2）微生物培养的过程中培养基中的成分包括碳源、氮源、水和无机盐。碳源进入细胞后，可参与合成含碳的生物大分子，如蛋白质和核酸等。

（3）电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，试卷第9页，总9页

使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种分子的分离，所以影响电泳速度的因素有带电性质的差异，分子本身大小、形状不同。凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，即最先分离出来的是分子量大的酶分子。

（4）酶反应速度指单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量。

【点睛】

本题考查微生物的培养和大分子物质的分离方法，意在考查考生对所学知识的识记和理解能力。

6．果胶 蒸馏水 增加果胶酶产生菌的浓度，确保能分离到所需的微生物 平板划线 温度降低，才不会杀死菌种（或“避免温度过高，杀死菌种”） 用蒸馏水定容（调节）到10mL（相同体积） 澄清度 固定化酶 【解析】

【分析】

微生物的分离是研究和利用微生物的第一步，也是微生物工作的基本方法和重要环节；土壤中的微生物很多，本题中要从土壤中获得果胶酶高产菌株；接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法，其中后者还可以用于菌种的计数。

【详解】

（1）根据表格分析，B用于定容，为蒸馏水；该培养基用于获得土壤中果胶酶高产菌株，因此A应该是果胶。用此配方进行选择培养，目的是增加果胶酶产生菌的浓度，确保能分离到所需的微生物。

（2）微生物常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，其中平板划线法需要使用接种环，且接种环灼烧灭菌后需要冷却至室温才能继续划线，以防止温度过高，杀死菌种。

（3）实验的目的是探究果胶酶的最适用量，实验方案为：向分别盛有1.0、1.5、2.0……4.0mL2%果胶酶溶液的一组试管内同时加入5mL苹果泥，用蒸馏水定容到10mL，适温水浴30分钟后，过滤每支试管的反应液，比较滤出的果汁体积或澄清度。

（4）根据题意分析，果胶酶与苹果泥混合在一起时，酶很难回收，不能再次利用，还可能影响了产品的质量，而固定化酶技术可以让产物与酶分离，使得酶可以反复使用，且提高了产品的品质。

【点睛】

试卷第10页，总9页

解答本题的关键是了解分离和培养果胶酶高产菌株的相关知识，识记微生物培养基的成分和作用，判断表格中A、B成分的种类，并能够分析接种和培养过程中的无菌操作。

7．CaCO3 无菌水 稀释涂布平板法 无氧 透明圈（或溶钙圈） 30~300 可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目 抗生素会抑制乳酸菌（或细菌）的繁殖 【解析】

【分析】

根据题意，乳酸能溶解周围环境中的难溶性碳酸钙，为检测某品牌酸奶中的乳酸杆菌含量是否达标，培养基中除了碳源、氮源、无机盐等成分外，还应加入CaCO3，以便于检测，在乳酸菌菌落周围可形成透明圈；分离微生物的常用方法有稀释涂布分离法和平板划线法，其中，前者可用于微生物的统计和计数，据此分析。

【详解】

（1）①配置培养基：培养基中除含水、无机盐、碳源、氮源和琼脂外，还需添加维生素和CaCO3。

②稀释样品：取1mL待测酸奶，用无菌水进行梯度稀释。

③接种培养：用稀释涂布平板法接种，乳酸菌是厌氧菌，培养时控制的气体条件是无氧。

④观察计数：菌落周围出现的溶钙圈就是乳酸杆菌的菌落，选择菌落数在30~300的平板计数。每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，目的是可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

（2）生产上不能用含有抗生素的牛奶发酵成酸奶，因为抗生素会抑制乳酸菌的繁殖。

【点睛】

本题考查微生物相关实验，要求学生能够根据题干信息，分析题意，并能设计相关实验对微生物进行鉴定和统计计数，难度不大。

8．破伤风芽孢杆菌具有控制明胶酶合成的基因 无以核膜为界限的细胞核 破伤风芽孢杆菌是厌氧菌，只有在无氧环境中才能进行旺盛的生命活动 20 破伤风芽孢杆菌周围会出现明胶液化现象 高压蒸汽 防止培养物被杂菌污染 防止污染环境 【解析】

【分析】

无菌技术指通过一定的物理、化学的手段，防止实验室培养物被外来微生物污染，保持微生物的纯培养的技术，其中包括在微生物的分离、转接、保存等过程中防止其他微生物污染的手段。目的是防止外来杂菌的入侵。

试卷第11页，总9页

方法：消毒和灭菌。

【详解】

（1）破伤风芽孢杆菌含有能控制明胶酶合成的基因，故可以控制明胶酶的合成，不能产生明胶酶的细菌很可能是缺乏该基因。

（2）破伤风芽孢杆菌是原核生物，酵母菌是真核生物，二者的主要区别是有无核膜包被的细胞核。破伤风芽孢杆菌是厌氧菌，只有在无氧环境中才能进行旺盛的生命活动，故在培养破伤风芽孢杆菌时需要严格控制氧气条件。

（3）为了避免温度引起培养基中的明胶液化，接种了破伤风芽孢杆菌的培养基应置于20℃恒温箱中培养，明胶在明胶酶的作用下分解，导致明胶失去凝固能力而液化，故一段时间后破伤风芽孢杆菌周围会出现明胶液化现象。

（4）使用后的培养基丢弃前一定要进行高压蒸汽灭菌处理。在微生物培养过程中，采用无菌技术的目包括防止培养物被杂菌污染、也防止污染环境和避免感染操作者。

【点睛】

消毒的常用方法：巴氏消毒法、煮沸消毒法、紫外线消毒法、化学药物消毒法；常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌法、干热灭菌法、灼烧灭菌法。

9．先增加后减少 乳酸菌在发酵过程中产生乳酸使得pH降低，知道相对适宜乳酸菌增殖，随着pH逐渐降低，以及发酵液的消耗，数目减少 灭菌 稀释涂布平板法 C、N元素以及维生素等 高压蒸汽灭菌 56 2.5 【解析】

【分析】

1．无菌技术的主要内容：

①对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；

②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌

③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；

④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

2、微生物常见的接种的方法

①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。

②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可试卷第12页，总9页

形成单个菌落。

3、微生物的筛选常用选择培养基进行，计数可以用血细胞净释放或稀释涂布平板法。

【详解】

（1）随着发酵时间延长，由于乳酸菌在发酵过程中产生乳酸使得pH降低，知道相对适宜乳酸菌增殖，随着pH逐渐降低，以及发酵液的消耗，数目减少。

（2）①配置牛奶发酵液，经巴氏消毒法消毒，加入已灭菌的3个发酵瓶中。 ③分别向3个发酵瓶中加入含适量等量的乳酸活菌的混合发酵剂，在41～43℃发酵，每隔半小时取样，并采用稀释涂布平板法法接种，培养后计数。 （3）①接种前现需要制作培养基，培养基中通常含蛋白胨，蛋白胨提供的主要营养有C、N元素以及维生素等，培养基灭菌常采用高压蒸汽灭菌法。 ②由于三个平板统计得到10、10、10三个稀释度的培养基上的平均菌落数依次为412个，56个、4个，符合30～300条件的只有56，所以此估算，每毫升样品中的乳酸菌数约为5.6×10个。 ③乳酸菌的存在对人体有利，据表可知，经过2.5h的发酵后，发酵液中活菌数最多，最适于饮用。

【点睛】

本题考查微生物的培养，考查对培养基制备、微生物计数方法的理解。解答此题，可根据乳酸菌的代谢特点和实验目的，确定培养基的物理性质和接种方法。

10．斜面 显微镜直接计数法 将菌液均分为3组 以淀粉为唯一碳源 存活率 死亡率（突变率） 每组至少涂布3个平板 【解析】

【分析】

为了探究紫外光处理时间对枯草芽孢杆菌的突变率和存活率的影响，其大致设计思路是：首先测定起始菌液的枯草芽孢杆菌浓度；再对随机均分的菌液进行不同时间的紫外光处理，然后对其分别计数，并取出等量菌液接种在淀粉为唯一碳源的培养基上和完全培养基中进行对比培养，最后观察统计每组培养基上菌落的存活率和突变率。

【详解】

（1）从临时保存菌种的斜面培养基中挑取菌体，制备成菌液，用稀释涂布平板法或显微镜直接计数的方法测定枯草芽孢杆菌的浓度。

（2）将菌液均分为三组，标记为A、B、C，分别用相同强度的紫外灯处理1min、3min、5min。

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（3）将每组处理后的菌液稀释适宜倍数，根据实验目的，部分涂布在3个以淀粉为唯一碳源的培养基上作为实验组，另外一部分等量菌液涂布在3个牛肉膏蛋白胨培养基上作为对照组。

（4）一段时间后，计数每个平板上的菌落数。其中牛肉育蛋白胨培养基上的菌落数可用于计算存活率，另一种培养基上的菌落数可用于计算突变率。

（5）由于实验步骤中，在用稀释涂布平板法进行接种培养、计数时，每种时间处理后的菌液只接种在1个平板培养基上，这样带来的结果容易出现偶然性，可行度不高，所以最好每组至少涂布三个平板。

【点睛】

本题考查微生物的分离和计数方法的知识点，要求学生掌握微生物分离的方法，学会利用选择培养基可以将不同微生物进行分离；掌握微生物的计数方法，运用血球计数板利用显微镜观察法进行计数或者运用稀释涂布平板法进行计数，识记稀释涂布平板法计数时的注意事项是解决该题的关键。

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