课题3　血红蛋白的提取和分离教学实录与评析

课题3

血红蛋白的提取和分离

【课题目标】

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

【课题重点与难点】

课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。

课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【导学诱思】

1．凝胶色谱法

凝胶色谱法也称做

，是根据

分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由

构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质

进入凝胶内部的通道，路程

，移动速度

；而相对分子质量

的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在

移动，路程

，移动速度

。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

2．缓冲溶液

缓冲溶液的作用是

。缓冲溶液通常由

溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是

，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。

3．电泳

电泳是指

。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上

。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷

的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子

以及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生不同的

，从而实现样品中各种分子的分离。

两种常用的电泳方法是

和

，在测定蛋白质分子量时通常使用

。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于

以及

等因素。

4．蛋白质的提取和分离

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

、

、

和

。

5．样品处理

血液由

和

组成，其中红细胞最多。红细胞具有

的特点。红细胞中有一种非常重要的蛋白质

，其作用是

，血红蛋白有

个肽链组成，包括

，其中每条肽链环绕一个

，磁基团可携带

。血红蛋白因含有

呈现红色。

红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的是

，采集的血样要及时采用

分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的

，将下层暗红色的

倒入烧杯，再加入

，缓慢搅拌

，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至

，表明红细胞已洗涤干净。

血红蛋白的释放

在

和

作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

分离血红蛋白溶液

将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的

，第2层为白色薄层固体，是

，第3层是红色透明液体，这是

，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

透析

取1mL的血红蛋白溶液装入

中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的

中，透析12h。透析可以去除样品中

的杂质，或用于更换样品的

。

6．凝胶色谱操作

第一步要制作

，第二步要

，因为

，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。在装填凝胶柱时，不得有

存在。因为气泡会

，降低分离效果。第三步是

。

【疑难点拨】

1．凝胶色谱法分离蛋白质的原理

凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动，相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空袭时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。

2．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义

哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

3．电泳的作用及其原理

电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

【典例解析】

用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（

D

）

A路程较长，移动速度较慢

B路程较长，移动速度较快

C路程较短，移动速度较慢

D路程较短，移动速度较快

解析：在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

【课本问题答案和提示】

（一）旁栏思考题

你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？

答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。

（二）练习

1．答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。

2．答：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。

缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。

3．答：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

4．答：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

5．答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

[课堂演练] 一．选择题

1．凝胶色谱法是根据（

B

）分离蛋白质的有效方法。

A分子的大小

B相对分子质量的大小

C带电荷的多少

D溶解度

2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（

B

）基本不变。

A温度

B

pH

C渗透压

D氧气浓度

3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（

B ）的电极移动。

A相同

B相反

C相对

D相向

4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（

A

）与氧气的运输有关。

A血红蛋白

B肌红蛋白

C肌动蛋白

D肌球蛋白

5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（

C

）的含量最多。

A白细胞

B血小板

C红细胞

D淋巴细胞

6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（

D

）。

A.

NaCl

B.甲苯

C.蒸馏水

D.柠檬酸钠

7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（

C

）

A无色透明的甲苯层

B脂溶性物质的沉淀层

C血红蛋白的水溶液

D其他杂质的暗红色沉淀物

二．非选择题

1．电泳利用了待分离样品中各种分子

以及

、

的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。

答案：带电性质的差异；分子本身的大小；形状的不同

2．你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

答案：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步。包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；在经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

参考资料

聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度

1．试剂的配制

（1）丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺

用去离子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液。由于丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中会分别缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一反应是由光或碱催化的。因此在每次使用前，应核实溶液的pH不超过7.0；并且应将配制好的溶液置于棕色瓶中，室温贮存，每隔几个月须重新配制。

（2）十二烷基硫酸钠（SDS）

用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。

（3）用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液

1.5 mol/L、pH8.8的Tris缓冲液（分离胶缓冲液）；1 mol/L、pH6.8的Tris缓冲液（浓缩胶缓冲液）。

（4）TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺) TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

（5）过硫酸铵

用去离子水配制10%的过硫酸铵溶液。过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。

（6）Tris—甘氨酸电泳缓冲液

25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。

（7）样品处理液

50 mmol/L Tris—HCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油。

（8）染色液

0.1%的考马斯亮蓝R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸。

（9）脱色液

10%的甲醇和10%的冰醋酸。

由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、

皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤，在老师的指导下完成。操作时要戴好一次性手套。

2．电泳

（1）根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板。

（2）配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液。用去离子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的过硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5 cm)，再在胶液面上小心注入一层水（约高2～3 mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。

（3）分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。

（4）配制SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。

（5）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理。在电泳样品中按1∶1体积比加入样品处理液，在100 ℃温度下加热3 min，以使蛋白质变性。

（6）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris—甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。

（7）按顺序加样，加样量通常为10～25 μL。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分离之后的样品。

（8）将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm处，关闭电源。

（9）从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。

（10）将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色1～2 h。换脱色液脱色3～10 h，其间需多次更换脱色液至背景清楚。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内使其不会降低染色强度。为保存永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。通过本实验的

电泳图谱，可以看见提取的血红蛋白的纯度并不是很高。