课题3　血红蛋白的提取和分离第二课时教案

血红蛋白的提取和分离

【基础知识】

1、分离蛋白质的原理：

蛋白质的物化理性质：分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质、对其他分子的亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

2、分离蛋白质的方法

(1)凝胶色谱法：

①概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

形态：微小的多孔球体②凝胶组成：大多数由多糖类化合物构成结构：内部有许多贯穿的通道

③原理：相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。

问题①凝胶色谱法分离过程是怎样的？

提示：蛋白质混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→先收集大分子→后收集小分子。

问题②凝胶的成分是什么？凝胶有何特点？

提示：成分：大多数是多糖类化合物构成的一些微小的多孔球体，如葡聚糖或琼脂糖。特点：小球体内部有许多贯穿的通道，可以分离不同相对分子质量的蛋白质。

(2)电泳法：

①概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

②原理：

a．许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。

b．在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

c．电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

③方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

由于琼脂糖本身不带电荷，各种分在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单子在电场中迁移速率决定于所带链，与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合电荷性质的差异及分子的大小、形物，使其迁移速率完全取决于分子的大状的不同

小

3、缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。

【实验操作】

蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质的不同会有很大差异。

1．样品处理

(1)红细胞的洗涤：

①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

②方法：

1

问题③：洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？

提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。

(2)血红蛋白的释放：

①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。

②过程：

(3)分离血红蛋白溶液：

将混合液离心→将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶沉淀层→于分液漏斗中静置片刻→分离出下层的红色透明液体。

问题④：在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？

提示：(1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。

(2)细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。

2.粗分离——透析

(1)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。

(2)目的：将相对分子质量较小(填“大”或“小”)的杂质除去。

(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

问题⑤：血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？

提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时机。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

3．纯化——凝胶色谱操作

(1)凝胶色谱柱的制作：

①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②柱底制作：打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

③柱顶制作：打孔→安装玻璃管。

④组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。

(2)凝胶色谱柱的装填：

①色谱柱固定于支架上。

②干凝胶的计算和称量。

③溶胀：干凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

④装填：打开下端出口，将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内。

⑤洗涤平衡：装填完后，立即连接洗脱瓶，用20 mmol/L的磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶12 h。

(3)样品的加入和洗脱：

调整缓冲液面：与凝胶面平齐

↓

滴加透析样品：用量为1 mL

↓

样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层

↓

洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱

↓

收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集

2

4．纯度鉴定

在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

【操作提示】

1．样品处理、分离与纯化的目的不同

目的

红细胞洗涤

去除杂质，如血浆蛋白

血红蛋白释放

使红细胞破裂，释放血红蛋白

分离血红蛋白溶液

经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开

透析

除去样品中相对分子质量较小的杂质

纯化

除去相对分子质量较大的蛋白质

2.对实验的分析

（1）红细胞的洗涤

①正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。

②分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。

③红细胞不纯净的原因：离心速度过高或时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀而造成。

（2）色谱柱填料的处理

商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需直接放在洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需1~2h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。

（3）凝胶色谱柱的装填

在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生这种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。

（4）蛋白质的分离

①若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。

②若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。

【课堂练习】

1、（2009年广东卷节选）（1）商品化植酸酶主要来自微生物。在产酶菌株筛选过程中，常在基本培养基中添加不溶于水的植酸钙制成固体平板，植酸钙被植酸酶分解后可在平板上产生 ，可根据其大小选择目的菌株，所得菌株需要进一步测定植酸酶活性。活性测定可以植酸钠作为底物，活性可用一定条件下单位时间的 表示。

（2）利用上述所得菌株制备植酸酶的流程如下图：

Ⅰ中的主要成分为 ；Ⅱ中包含植酸酶等多种蛋白质。请写出一种纯化得到植酸酶的方法及其依据。

（1）透明圈；植酸钠的消耗量（减少量）或磷酸（肌酸）的生成量（产量）；

（2）小分子杂质，凝胶色谱法：根据蛋白质之间的分子大小、吸附性质等差异进行纯化（或电泳法：根据蛋白质之间的电荷、分子大小等差异进行纯化）；

2、血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。

3

(1)将实验流程补充完整：A为________________，B为________________。凝胶色谱法是根据________________而达到蛋白质分离的有效方法。

(2)洗涤红细胞的目的是去除________，洗涤次数过少，无法除去________________；离心速度过高和时间过长会使______________一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是____________________。释放血红蛋白的过程中起作用的是________________。

(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是_______________。如果红色区带________，说明色谱柱制作成功。

【答案】

(1)血红蛋白的释放

样品的加入和洗脱

相对分子质量的大小

(2)杂蛋白(血浆蛋白) 血浆蛋白

白细胞和淋巴细胞

离心后的上清液中没有黄色

蒸馏水和甲苯

(3)准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致

均匀一致地移动

3、如图表示血红蛋白提取和分离实验的部分装置或操作方法，请回答下列问题：

(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是_____________________________。

(2)图甲表示________过程，该操作目的是去除样品中________________的杂质。现有一定量的血红蛋白溶液，进行上述操作时若要尽快达到理想的实验效果，可以________________(写出一种方法)。一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色，并说明判断的依据：________________________________。

(3)观察图乙，往色谱柱中加样的正确操作顺序是________(用序号表示)。在进行④操作前，应该等样品________________，且要________(填“打开”或“关闭”)下端出口。

(4)图丙表示电泳法分离蛋白质的结果，不同蛋白质得以分离是因为________。

【答案】

(1)防止红细胞吸水破裂(2)透析(粗分离) 相对分子质量较小

增加缓冲液的量(或及时更换缓冲液) 出现紫色；双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血清蛋白质反应，生成紫色物质(3)②③④①

完全进入凝胶层

关闭(4)不同蛋白质所带电荷性质、分子大小和形状不同，导致电泳时迁移速度不同

4、对蛋白质进行研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：

(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：________、________、________和纯度鉴定。

(2)在血红蛋白的提取与分离实验中，采集新鲜血液前要在采血容器中加入柠檬酸钠溶液的目的是______________。

(3)样品的处理过程又可以细分为：红细胞的洗涤、________和分离血红蛋白溶液。其中分离血红蛋白溶液时需要用到________(仪器)分出下层红色透明液体。

(4)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析进行粗分离。

①透析的目的是__________________________________________________；

4

②透析的原理是_________________________________________________。

(5)装填凝胶色谱柱时，要注意色谱柱内不能有气泡，一旦发现有气泡必须重新装填。这是因为____________________________________________________。

(6)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

①样品纯化的目的是______________________________________________；

②血红蛋白的特点是______________________________________________；

这一特点对分离蛋白质的意义：________________________________。

【答案】

(1)样品处理

粗分离

纯化

(2)防止血液凝固

(3)血红蛋白的释放

分液漏斗

(4)①去除相对分子质量较小的杂质

②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则被留在袋内

(5)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果

(6)①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂蛋白除去

②呈现红色

在用凝胶色谱法分离血红蛋白时，可以通过观察颜色来判断什么时期应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作

5、血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和部分CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题：

(1)将实验流程补充完整。

(2)凝胶色谱法的基本原理是根据________分离蛋白质。

(3)洗涤红细胞的目的是去除________，洗涤干净的标志是________________。

(4)下图1是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入示意图，正确的加样顺序是____________。如果红色区带________，说明色谱柱制作成功。

图1 (5)图2、图3分别是同学甲、乙利用同一种样品分离得到的结果，则图3中与图2中蛋白质P对应的是________。

图2 SDS凝胶图3 Sephadex G－75

电泳结果凝胶色谱分离结果【答案】

(1)血红蛋白的释放

凝胶色谱柱的装填

(2)相对分子质量的大小

(3)杂蛋白(或血浆蛋白) 离心后的上清液中没有黄色

(4)④①②③

均匀一致地移动

(5)丙

6、下面是某研究小组开展的“猪血浆某白蛋白的提取及分子量测定”研究，请协助完成有关问题。

材料仪器：新鲜猪血、低速冷冻离心机、透析袋、电泳仪等化学试剂：pH为7.4的缓冲液、5

柠檬酸钠、奈氏试剂(与NH4反应出现黄色或红棕色沉淀)、饱和(NH4)2SO4溶液、生理盐水等

实验步骤

（1)样品获取：向新鲜猪血中加入________，静置一段时间后取上层血浆。

(2)盐析法粗提蛋白质：

①向血浆中加入一定体积饱和(NH4)2SO4溶液，使(NH4)2SO4的浓度达到50%，充分混合后静置、离心，取沉淀物。

②向沉淀物中加入适量生理盐水使之溶解，再向其中加入一定体积的饱和(NH4)2SO4溶液，使(NH4)2SO4的浓度达到33%，充分混合后静置、离心，取沉淀物。

③重复步骤①、②2～3次，最后用生理盐水将沉淀溶解即得粗提品。

盐析粗提“血浆某白蛋白”的主要原理是________________，重复步骤①、②的主要目的是________________。

(3)透析除盐：将粗提品装入透析袋，以pH为7.4的缓冲液作透析液，每隔4 h更换一次透＋析液，每次更换前利用奈氏试剂检测透析液中NH4量。利用缓冲液做透析液的目的是________________________。检测中，若观察到透析液__________________时，即可终止透析。

(4)凝胶色谱法分离：透析后的样品经凝胶柱洗脱，获得纯净血浆某白蛋白样品。

(5)分子量测定：化学物质SDS能使蛋白质变性，解聚成单条肽链。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中加入一定量的SDS，电泳迁移率完全取决于肽链的分子大小。右图为本实验中用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血浆某白蛋白的结果。根据电泳结果，某同学得出“提取的血浆某白蛋白有两条肽链”的结论，这种说法可靠吗？理由是__________________________。

【答案】

(1)(适量的)柠檬酸钠

(2)该血浆白蛋白在50%和33%的(NH4)2SO4，溶液中溶解度低

除去更多的杂蛋白

(3)防止pH变化对蛋白质结构的影响

不出现黄色或红棕色沉淀

(5)不可靠，只能得出提取的血浆某白蛋白含有两种大小不同的肽链，不一定是两条

7、某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的“血红蛋白提取、分离流程图”如下：

实验准备液、血细胞→样品处理碎、离心蛋白质→粗分离纯化、纯度→色谱法、电

＋请回答下列有关问题：

(1)样品处理中红细胞的洗涤要用________________反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH＝7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是________________。

(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是________，若要尽快达到理想的透析效果，可以________(写出一种方法)。

(3)电泳利用了待分离样品中各种分子的___________________________________等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。

(4)一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如下图所示。由图可知携带者有________种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是________________________________________________________。

【答案】

(1)生理盐水

渗透原理(当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水胀破)(2)除去小分子杂质

增加缓冲液的量或及时更换缓冲液(3)带电性质以及分子大小、形6

状(4)2 携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质

7