复习与测试教学目标

专题五 DNA与蛋白质技术

课题1 DNA的粗提取与鉴定

一、教学目标

（一）知识与技能

1.通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质。

2.理解DNA粗提取与鉴定的原理。

（二）过程与方法

掌握DNA如提取计数，能利用DNA的性质进行实验设计和操作。

（三）情感、态度与价值观

通过对DNA的粗提取的实验过程的设计及操作，锻炼科学的思维方法，培养实事求是的科学态度。

二、教学重点难点

重点：DNA的粗提取和鉴定方法

难点：DNA的粗提取和鉴定方法

三、教学过程

一、提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？

1.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同； DNA不溶于酒精。

①在0.14mol/L时溶解度最小；较高浓度可使DNA溶解；0.14mol/L可使DNA析出。

②在溶解细胞中的DNA时，人们通常选用2mol/LNaCl溶液；将DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释NaCl溶液。

酒精是一种常用有机溶剂，但DNA却不能溶于酒精（特别是95％冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。

2.预冷的乙醇溶液具有以下优点：

一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；

二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；

三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。

3.采用DNA不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？

将DNA和蛋白质进一步分离

4.提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？

蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。

温度值为60～80℃，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。

补充：DNA的变性是指DNA分子在高温下解螺旋，其温度在80℃以上，如在PCR技术中DNA变性温度在95℃。

5.洗涤剂在提取DNA中有何作用？

洗涤剂将细胞膜上的蛋白质，从而瓦解细胞膜。

6.当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用什么指示剂进行鉴定？

在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺呈现蓝色。

原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取和提纯DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。

二、实验材料的选取

本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因：

一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；

二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。

鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。

三、破碎细胞，获取含DNA的滤液

1.若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含DNA的滤液？

在鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；

切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。

2.为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？

蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。

3．在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？

过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。

血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解DNA物质；选用尼龙布进行过滤。

4.在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？

破碎细胞壁，使核物质容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分会使DNA的提取量减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。

具体做法：10mL鸡血＋20mL蒸馏水→同方向搅拌→3层尼龙布过滤→滤液

三、去除滤液中的杂质

1.为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？

用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；

方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；

方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

方案二与方案三的原理有什么不同？

方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。

四、析出与鉴定

1.在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA呈何颜色？

滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置2～3分钟，析出的白色丝状物就是DNA。DNA呈白色。

2.怎样鉴定析出的白色丝状物就是DNA呢？

具体做法：

试管2支，编号甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均匀→沸水浴5min→观察颜色变化

五、实验操作

制备鸡血细胞液 加柠檬酸钠，静置或离心

↓

破碎细胞，释放DNA 加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌

↓ 过滤，除去细胞壁、细胞膜等

溶解核内DNA 加入NaCl至2mol/L，同一方向缓慢搅拌

↓

DNA析出 加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到2mol/L溶液中

↓ 除去细胞质中的大部分物质

DNA初步纯化 与等体积95％冷却酒精混合，析出白色丝状物

↓ 除去核蛋白、RNA、多糖等

DNA鉴定 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色

注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。

小结：DNA粗提取与鉴定实验中四个关键操作的目的

(1)两次加入蒸馏水

次数

目的

第一次

使鸡血细胞吸水涨破

第二次

稀释NaCl溶液，使DNA逐渐析出

(2)三次加NaCl溶液

次数

目的

第一次

溶解DNA，析出蛋白质等杂质

第二次

使DNA再溶解，为了获得含杂质较少的DNA 第三次

(3)三次过滤

次数

溶解DNA，以便DNA与二苯胺反应

目的

第一次

单层

除去细胞破碎后的细胞膜、核膜、糖类、蛋白质等，获得含核物质的滤液

第二次

两层

除去不溶于2 mol/L NaCl溶液中的蛋白质等杂质，获得含DNA的滤液

第三次

多层

除去溶于0.14 mol/L NaCl溶液中的杂质，获得含DNA的丝状物

(4)六次搅拌

次数

实验操作

目的

第一次

搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液

加速细胞破裂

第二次

搅拌含DNA的高浓度盐溶液

加速DNA的溶解

第三次

搅拌加蒸馏水的NaCl溶液

析出DNA 第四次

搅拌含DNA的高浓度盐溶液

加速DNA的溶解

第五次

搅拌含DNA的酒精溶液

提取含杂质较少的DNA 第六次

对点训练

搅拌含DNA的白色丝状物的盐溶液

加速DNA的溶解

知识点一

提取DNA的方法

1．DNA的粗提取与鉴定实验，与下列哪项原理无关(

)

A．DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中，溶解度最低

B．DNA易被龙胆紫溶液染成紫色

C．DNA溶液中加入二苯胺试剂，加热后产生蓝色

D．加入95%的冷酒精，DNA会从溶液中析出

2．下列图示中能正确反映DNA溶解度与NaCl溶液浓度之间关系的是(

)

知识点二

DNA的提取流程

3．下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验装置：

(1)

实验材料选用鸡血细胞液，而不用鸡全血，主要原因是鸡血细胞液中有较高含量的____________。

(2)在图A所示的实验步骤中加蒸馏水的目的是________，通过图B所示的步骤取得滤液，再在溶液中加入2

mol/L的NaCl溶液的目的是___________________________________；图C所示实验步骤中加蒸馏水的目的是________。

4．将粗提取的DNA丝状物分别加入0.14

mol/L

NaCl溶液、2

mol/L

NaCl溶液、体积分数为95%的酒精溶液中，然后用放有纱布的漏斗过滤，分别得到滤液P、Q、R以及存留在纱布上的黏稠物p、q、r，其中由于含DNA少可以丢弃的是(

) A．P、Q、R

B．p、q、r

C．P、q、R

D．p、Q、r

四、课堂小结

五、板书设计

课题1 DNA的粗提取与鉴定

一、实验原理

二、实验材料的选取

三、去除滤液中的杂质

四、析出与鉴定

五、实验操作