课题3　分解纤维素的微生物的分离优质教案设计

分解纤维素的微生物的分离教学案

分解纤维素的微生物的分离教学案

永州四中周玉柏

一、基础知识

1、纤维素

①纤维素含量

纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，是天然有机高分子化合物：自然界中纤维素含量最高的天然产物是棉花，含量达92％～95％，亚麻达80％，此外木材、作物秸秆也富含纤维素。

许多商品纤维素都是由天然纤维素制得：如水溶性的羧甲基纤维素钠（CMC---Na）；不溶于水的微晶纤维素等食品添加剂。

②基本单位：

③简式：

④应用：纤维素可用于纺织工业，可造纸

⑤思考：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？

40～60%能被土壤中的某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶

2、纤维素酶

①定义：水解纤维素生成纤维二糖和葡萄糖的一类酶的总称

②组分：纤维素酶不是单一酶，是复合酶，包括C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。

C1酶：(外切酶) 从糖链的末端开始切掉两个葡萄糖分子，产生纤维二糖。

CX酶：(内切酶) 作用于糖链的内部使之断裂成糖链片段。

葡萄糖苷酶：将纤维二糖分解为葡萄糖

③思考

A、人能不能对纤维素消化吸收？为什么？

答：不能，因为人体不能合成纤维素酶。人以淀粉为主要的能量来源。

B、食物中的纤维素有什么作用？

答：食物中的膳食纤维可刺激胃肠蠕动和分泌消化液，有助于食物的消化和排泄。

C、反刍动物能利用纤维素吗？为什么？

答：能，在反刍动物的瘤胃中生活着大量可以分解纤维素的微生物，能产生大量的纤维素酶

3、纤维素酶活性的测定实验：

方法：滤纸崩溃法

下列生物能分解纤维素的是（

）

①人

②兔

③牛

④蘑菇

⑤纤维杆菌

A、①②③④⑤

B、②③⑤

C、②③④⑤

D、③⑤

二、纤维素分解菌的筛选

1、筛选方法：刚果红染色法

2、筛选原理：刚果红（CR）是一种染料，它可以与象纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应

3、筛选过程：

4、纤维素分解菌的选择培养基和鉴别培养基

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思考：

A、物理性质上看选择培养基的类型及原因

答：液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体培养基培养以增加纤维素分解菌的浓度

B、培养基具有选择作用的原因

答：能够产生纤维素酶的微生物才能分解纤维素作为碳源和能源，并大量繁殖；不能分解纤维素的微生物由于缺乏碳源受到抑制而不能正常生长繁殖，因此培养基具有选择作用

C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？

答：用牛肉膏蛋白胨培养基与其对照

D、为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

答：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速的繁殖。而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到浓缩的作用。

三、实验设计

1、实验流程P28

本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？

课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。

本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。

面其他步骤基本一致。

2、操作步骤

（1）土壤取样：

①分布环境：富含纤维素的环境中

②原因：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

③实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。

④讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？

答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。

（2）选择培养

①目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物

②操作：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d，至培养基变混浊。吸取一定的培养液（约5 mL），转移至第

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另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。

（3）梯度稀释：

吸取上清液1 mL富集后的培养液，注入盛有9 mL的无菌水的无菌大试管中，充分混匀；然后再用一只1 mL无菌吸管从此试管中吸取1 mL注入另一盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释至106稀释度。

（4）涂布培养

将鉴别培养基平板分别标号，分别将稀释度为106～104的菌悬液各取0.1mL，对号滴加到鉴别培养基平板，并用涂布器均匀涂布。将培养基平板于300C倒置培养,至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板

（5）筛选菌株：

1、刚果红染色法: ①方法

常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行染色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红

方法一：在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg/ml的CR溶液，10～15分钟后，倒去CR溶液，加入物质量浓度为1mol/L的NaCL溶液，15分钟后倒掉NaCL溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围就会出现透明圈。

氯化钠的作用是：可以使结合不牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小的透明圈. 方法二：配制质量浓度为10mg/mL的CR溶液，灭菌后，按照每200mL培养基加入1mL的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈

③讨论：这两种方法各有哪些优点与不足？

方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。

方法二优点是操作简便，不存在菌落混杂的问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应，但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间的培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

2、挑菌

在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－

370C培养，可获得纯培养。

四、课题延伸

本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选。但是这还只是分离纯化的第一步为确定得到是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。

1、固体发酵：指微生物在没有或几乎没有游离水的固态的湿培养基上发酵的过程。

例：农村的堆肥、青饲料和做酒曲。

2、液体发酵：呈液体的微生物发酵过程。

现代微生物工业多为液体发酵，因适用面广，可精确调控、效率高、可机械化和自动化。

3、纤维素酶的测定

一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定

4、葡萄糖的测定

葡萄糖分子结构中含有还原性基团，可与斐林试剂发生作用，生成砖红色沉淀。

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分解纤维素的微生物的分离教学案

1、刚果红是一种酸性染料，能将下列哪些物质染色（

）

①纤维二糖②葡萄糖③纤维素④苏木精⑤弹性纤维

A、①③④

B、①②③

C、②③④

D、③④⑤

2、分离土壤中纤维素分解菌用到的方法（

）

①

稀释倒平板法

②

涂布平板法

③

单细胞挑取法

④

选择培养基法

A、①②

B、①②③④

C、②③

D、①③④

3、在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养

基之前一般要先进行选择培养，其主要目的是

A完全除去其它微生物

B没有意义，去掉这一步更好

C增加纤维素分解菌的浓度

D使纤维素分解菌充分长大

4、在对纤维素分解菌进行选择培养时用液体培养基的目的是

A用液体培养基可获得大量菌体

B纤维素分解菌适宜在液体培养基上生长

C用液体培养基可以充分利用培养基中的营养物质

D用液体培养基可获得高纯度的纤维素分解菌

5、分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是

A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

B．选择培养这一步可省略，但培养的纤维素分解菌少

C．菌液经稀释后，涂布到培养基上后，加刚果红染色

D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上

6.富集培养是微生物学中最强有力的技术手段之一。主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定环境条件，使仅适应该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。

富集条件可根据所需分离的微生物的特点，从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。下图描述了采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。

(1)本实验所需培养基为________________，碳源为________________ (2)①一③重复培养的目的是______________________________ (3)⑤的菌落中大部分是降解_______________的微生物。

(4)⑥为__________组，⑦为_________组，设置⑥的目的___________________________ (5)⑤→⑥操作,接种到⑥的培养基中，在操作过程中为防止污染应注意的事项是

7、制备各种牛肉膏蛋白胨固体培养基，倒平板的具体描述正确的是

①待培养基冷却至40℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板②将灭过菌的培养皿放在火焰旁桌面上，左手拔出棉塞③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰

④用右手的拇指和食指打开第

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分解纤维素的微生物的分离教学案

皿盖⑤右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖

⑥等待平板冷却5～10s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，底在上

A．①③④⑤

B．④⑤⑥

C．②③⑤

D．①②④⑥

8、用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，(没有杂菌污染)其结果与实际值比

A、比实际值要高

B、比实际值要低

C、和实际值一样

D、

比实际值可能高也可能低

9、下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是

A、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水

B、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、水

C、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、水

D、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水

10、下列为纤维素分解菌的鉴别培养基配方，请设计实验测定该培养基用于鉴定纤维素分解菌的最适PH CMC-Na、酵母膏、磷酸二氢钾、琼脂、土豆汁、蒸馏水1000ml及相关无机盐

实验步骤：

（1）配制培养基

（2）

（3）

。

（4）

。

（5）放在适宜条件下培养，观察并记录结果。

（6）仅凭1次实验能否准确测出培养基的最适PH？为什么？

在筛选纤维素分解菌的过程中，常用方法是

11.利用纤维素解决能源问题的关键，是高性能纤维素酶的获取。请完善实验方案，并回答相关问题。

【实验目的】比较三种微生物所产生的纤维素酶的活性。

【实验原理】纤维素酶催化纤维素分解为葡萄糖，用葡萄糖的产生速率表示酶活性大小；用呈色反应表示葡萄糖的生成量。

【实验材料】三种微生物（A～C）培养物的纤维素酶提取液，提取液中酶蛋白浓度相同。

【实验步骤】

（1）取四支试管，分别编号。

（2）在下表各列的一个适当位置，填写相应试剂的体积量，并按表内要求完成相关操作。

（3）将上述四支试管放入37℃的水浴，保温1小时。

（4）在上述四支试管中分别加入

试剂，摇匀后，进行

处理。

（5）观察比较实验组的三支试管与对照组试管的颜色及其深浅。

【实验结果】

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分解纤维素的微生物的分离教学案

微生物A提取物微生物B提取物微生物C提取物颜色深浅程度＋＋＋＋＋＋【分析讨论】

（1）该实验中的对照组是

号试管。

（2）实验组试管均呈现的颜色是

，但深浅不同。

（3）上述结果表明：不同来源的纤维素酶，虽然酶蛋白浓度相同，但活性不同。若不考虑酶的最适pH和最适温度的差异，其可能原因是

。

（4）你认为上述三种微生物中，最具有应用开发价值的是

。

（5）从解决能源问题的角度，开发这种纤维素酶的意义在于

。

12．在细菌的纯培养中，可在无菌条件下，用已灭菌的接种环(或接种针)，把纯种细菌(培养在试管中)接种在含有营养物质的固体培养基上(一般可用培养皿放置)，该种细菌在适宜条件下会迅速繁殖，形成菌落。请根据提供的材料设计一个简单实验探究抗生素A和抗生素B的杀菌效果。

(1)在下图中画出设计方案示意图并注明名称(三个培养皿均含相同培养基，无菌条件操作)。

(2)预测实验结果并分析：

①经过一段时间后，若Ⅱ号培养皿和Ⅲ号培养皿均没有菌落，则说明抗生素A和抗生素B杀菌效果相同；

②________________________________________________________________________；

③________________________________________________________________________；

④若Ⅱ、Ⅲ号培养皿内均有大量菌落，说明抗生素A和抗生素B均无杀菌功效。

13．某生物兴趣小组打算进一步探究纤维素分解菌的作用，请帮助完成相关实验设计：

(1)问题：纤维素分解菌能否分解淀粉呢？

(2)假设：__________________________________________________________________。

(3)实验步骤

①配制两份相同的含淀粉的且适合纤维素分解菌生长的液体培养基。

②向其中一组培养基__________，另一组不做处理。

③将上述两组培养基置于相同且适宜条件下培养一段时间。

④向两组培养基中分别滴加3滴碘液，观察颜色变化。

(4)实验结论

①_____________________________________________________________，则假设成立。

②___________________________________________________________，则假设不成立。

12答案：(1)

(2)若②Ⅱ号培养皿内无菌落，而Ⅲ号培养皿内菌落与I号相同，说明抗生素A有杀菌功效，而抗生素B无杀菌功效

③若Ⅲ号培养皿内无菌落，而Ⅱ号培养皿内菌落与I号相同，说明抗生素B有杀菌功效，而抗生素A无杀菌功效

13答案：(2)纤维素分解菌不能分解淀粉(3)②接种适量的纤维素分解菌

(4)①两组培养基中溶液均变蓝且程度相同

②接种纤维素分解菌的培养基中的溶液不变蓝或蓝色程度低于另一组

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