课题3　血红蛋白的提取和分离优质课教案

课题3：血红蛋白的提取和分离

教学目标：

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

教学重点：凝胶色谱法的原理和方法

教学难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

教学过程：

（一）引入新课

蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？

（二）进行新课

1．基础知识

1．1凝胶色谱法

（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

1．2凝胶电泳法：

（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。

（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

2．实验设计

2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？

不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。

2.2选择实验材料

（1）你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？

哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。

2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。

洗涤红细胞的目的是什么？除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。

红细胞的洗涤过程为

血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水

→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀

补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家

采取了离心分离的方法：

红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏[来源:学科网ZXXK]1

斗分离出血红蛋白

2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。

透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。

总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第三个步骤――纯化（凝胶色谱操作）。

2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。

根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。

橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。

色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱

下面进行第二步――凝胶色谱柱的装填。

色谱柱的装填过程。

步骤

①

②

[来源:学科网ZXXK]操作要求

色谱柱垂直固定在支架上

根据色谱柱体积计算凝胶用量

凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀

凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴

一次性缓慢倒入；轻轻敲打

立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h 操作要求

计算称量凝胶

配制悬浮液

装填悬浮液

缓冲液洗涤平衡

③

④

⑤

样品加入和洗脱。其基本过程是：

调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质

至此，血红蛋白即可得到纯化。

纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺经胶电泳

分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

在整个操作过程中，应当注意以下事项：

（1）红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

（2）凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡

（3）色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。

（4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。

本堂小结：

获取血红蛋白溶液:

2

当堂反馈: 1.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（ A ）

A.可采集猪血作为实验材料 B.用蒸馏水重复洗涤红细胞

C.血红蛋白释放后应低速短时间离心 D.洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液

2.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是（ A ）

A.气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果

B.气泡阻碍蛋白质的运动

C.气泡与蛋白质发生化学反应

D.气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密 3.下列操作正确的是（ D ）

A.分离红细胞时采用低速长时间离心 B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可

C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D.透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h 4.选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列不是其优点的是 ( D ) A.血红蛋白是有色蛋白

B.红细胞无细胞核

C.红细胞蛋白质含量高

D.红细胞DNA含量高

5.在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是 ( D ) A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐

B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果

C洗涤过程选用0.1%的生理盐水

D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质下

6.下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，不正确的是 ( A ) A.采集血样后要高速短时问离心获得血细胞

B.洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。

C.在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白

D.释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来

★教后小记

本课题重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和提取的基本技术。可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。

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