课题3　血红蛋白的提取和分离教案设计

课题3

血红蛋白的提取和分离

1、【课题目标】

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

2、【课题重点与难点】

课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。

课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

3、【教学准备】

多媒体课件，视频

4、【课时安排】

3课时

5、【教学方法】

启发探究性学习教学

6、【教学过程】

【导学诱思】

思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？

选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。

思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。

思考3 高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质

的何种作用，作用结果是什么被破坏？

变性、变性、空间结构

思考4 人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪

的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，猪的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。

一、基础知识：

㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）：

1、凝胶：

一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）

2、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。

3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ 相对分子质量较小 ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ 较长 ），移动速度（较慢

），而（ 相对分子质量较大

）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ 凝胶外部 ）移动，路程（ 较短），移动速度（ 较快），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

随堂练习

1、用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质 ( D ) A．路程较长，移动速度较慢

B．路程较长，移动速度较快

C．路程较短，移动速度较慢 D．路程较短，移动速度较快

2、相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个（B）

㈡ 缓冲溶液：

1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

2、作用：

能够抵制（ 外界的酸或碱

）的对溶液的（ PH ）的影响，维持PH基本不变。

3、缓冲溶液的配制

通常由（1－2 ）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（使用比例 ）就可以制得（

在不同PH范围内

）使用的缓冲液。

思考：说出人体血液中缓冲对。

NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？

使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）

㈢电泳：

电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

1、原理：

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电

②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离

2.分类：

琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

测定（ 蛋白质相对分子质量 ）通常用 SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳

随堂练习

使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于

A 电荷的多少 B 分子的大小

C 肽链的多少 D 分子形状的差异

如图所示

每个肽链环绕（

一个亚铁血红素基团 ），此基团可携带（一分子氧或一分子二氧化碳）。血红蛋白因含有（

血红素）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。

(1)红细胞的洗涤

①目的：去除（

杂质蛋白

）

②方法：（低速短时间

）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达

不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（黄色血浆），将下层（

暗红色 ）的红细胞液体倒入（烧杯）再加入用（五倍体积 ）的（

生理盐水）质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤

⑤低速离心（低速短时间）

⑥重复4、5步骤（ 三 ）次，直至上清液中已没有（

黄色

），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。

(2)血红蛋白的释放

加（

原血液）到（

蒸馏水）体积，再加40％体积的（甲苯）（ 溶解细胞膜）

，置于（磁力搅拌器）上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白. (3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层: 第1层（最上层）：（

甲苯层 ）

第2层（中上层）：（

无色透明）的沉淀层，（ 白）色薄层固体脂溶性物质

第3层（中下层）：（

血红蛋白）的水溶液层（

红色透明）的液体

第4层（最下层）：其它杂质（暗红色）的沉淀层

用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

(4)透析

取( 1)ml的血红蛋白溶液装入（透析袋

）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（磷酸缓冲液

）中，pH为（7.0），透析12小时，目的是（

除去样品中分子量较小的杂质 ）或用于更换样品中的（缓冲液 ）。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。

2.凝胶色谱制作

1）凝胶色谱柱的制作

①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安装移液管头部 覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。a、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；b、在橡皮塞顶部切出锅底状的（

凹穴

），在0.5ml的（

移液管）头部切下（5cm）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。

底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。

c.剪尼龙网小圆片覆盖在（

橡皮塞的凹面）上，用（100目）的尼龙纱将橡皮塞（出口部位 ）包好，插到玻璃管一端。

d、色谱柱下端用移液头部做（

尼龙管

），连接一细的（打开与关闭

），并用螺旋夹控制尼龙管的（

色谱流出液），另一端放入收集（ ）的收集器内

③顶塞的制作：

插入安装了玻璃管的橡皮塞

④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。

⑤安装其他附属结构。

（1）凝胶的选择：

（G-75）：

“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度

及分离范围。

75表示凝胶的得水值，即每克凝胶

膨胀时吸水7.5克。

交联葡聚糖凝胶

（2）方法：

配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（

蒸馏水）中充分溶胀后，配成（

凝胶悬浮液

）。

（3）凝胶色谱柱的装填方法

①固定：将色谱柱处置固定在支架上

②装填：

将（凝胶悬浮液 ）一次性的缓慢倒入（

色谱柱）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。

注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

③洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在( 50cm)高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分（洗涤平衡）12小时。

注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。 3）样品加入与洗脱

2）凝胶色谱柱填料的处

①加样前

打开下端出口，使柱内凝胶面上的（缓冲液 ）缓慢下降到与（

凝胶面 ）平齐，关闭出口

②加透析样品

①调整缓冲液面：与凝胶面平齐

②滴加透析样品：用（

吸管

）将1ml（

透析液）的样品加到色谱柱的（

顶端）

③样品渗入凝胶床：（

样品完全进凝胶层

）

④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱

⑤收集：待（

红色的蛋白质

）接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每（5ml）收集一试管连续收集

注意正确的加样操作：

①不要触及破坏凝胶面 ②贴壁加样

3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

判断（ 纯化 ）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。

三

实验结果分析与评价

观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

讨论：如何测定蛋白质的分子量？

使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售