课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计范文

专题5 DNA和蛋白质技术

课题3 血红蛋白的提取与分离

【基础知识】正常人的血浆近中性，PH为7.35--7.45，血液由 和各种 组成，

其中 最多。

一、蛋白质的提取和分离一般分为四步：

_____ ______、_______ _ ____、______ __、________ ________ （一）样品处理

1．红细胞的洗涤：

（1）目的：______________，以利于后续步骤的分离纯化。

（2）方法：

2．血红蛋白的释放：

（1）在________和________的作用下，借助磁力搅拌器搅拌10 min，使红细胞破裂，释放出血红蛋白。

（2）蒸馏水的作用是 ，40%体积的甲苯作用是 借助磁力搅拌器搅拌10 min的作用 3．分离血红蛋白溶液 （1）将搅拌好的混合液转移到 中，以2000 r/min 的速度离心10 min后，可明显看到试管中的溶液分4层： （2）将试管中的液体用 过滤、除去 ，

于 中静置片刻后，分离出下层

的 ，即血红蛋白溶液。

（二）透析——粗分离

1．原理：透析袋能使________自由进出，而将________保留在袋内。

2．过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入________中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L 的______________中，透析12 h。

3．目的：去除样品中_____________________的杂质。

（三）纯化——凝胶色谱法

【基础知识】 （1）

生物体内的蛋白质多种多样，由于科学研究的需要把它们分开，分离蛋白质常使用的方法是

和 ，两者都是根据不同蛋白质分子之间的差异来分离

（2）蛋白质特性的差异，如分子的_______________、溶解度、吸附性质、所带________的性质和多少、

对其他分子的亲和力等。

1．凝胶色谱法：

（1）也称作____________法，是根据________________的大小分离蛋白质的有效方法。

(2)原理：（结合课本P65图5-13）

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形态：微小的___________ ①凝胶 组成：大多数由___________构成

结构：内部有许多___________ ②分离原理：相对分子质量____的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较____ ，移动速度较慢，而相对分子质量_____ 的蛋白质无法进去凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较____，移动速度较快，从而分离___________不同的蛋白质分子。

③结果：相对分子质量 的蛋白质行程较短，速度较快，先从凝胶柱中洗脱出来

，相对分子质量 的蛋白质行程较长，速度较慢，后从凝胶柱中洗脱出来 （3）缓冲溶液 ①概念：在一定范围内，能够抵制外界的 和 对溶液pH的影响，维持pH基本不变溶液。 ②缓冲溶液的配制：缓冲溶液通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的 就可以制得 的缓冲液。

[想一想] 维持人体血液pH稳态的缓冲对有哪些？

在血红蛋白的提取和分离整个实验中用的缓冲液是什么？

使用该缓冲液的目的是什么？

（4）凝胶色谱柱的制作：打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管

。

（5）凝胶色谱柱的装填

①材料：实验所用凝胶是 。

②方法：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有 存在。然后用300mL物质的量浓度为20 mmol/L 充分洗涤平衡12h，使凝胶装填紧密。 （6）样品的加入和洗脱

使吸管管口沿管壁将样品缓慢加入 内，不要破坏凝胶面。待红色的蛋白质接近色谱柱低端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。

（四）纯度鉴定——电泳

1．判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是

电泳。

2.电泳法：指________粒子在电场的作用下发生________的过程。

3．原理：

（1）许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的______条件下，这些

基团会带上__________________。

（2）在电场的作用下，这些________分子会向着与其所带电荷_______的电极移动。

（3）电泳利用了待分离样品中各种分子________的差异以及_________的大小、__ __的不同，使带

电分子产生不同的______，从而实现样品中各种分子的分离。

【凝胶色谱法和电泳法的比较】

凝胶色谱法是依据 大小，利用 使 分子优先洗脱出来，而 分子后分离出来的方法。 电泳法则是依据各种分子 的差异，以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的 速度，从而实现在电场中将各种分子分离的方法

（五）实验注意事项

1．红细胞的洗涤：___________、离心速度与离心时间非常重要，__________过少，无法除去血浆蛋

白；离心速度过高和时间过长会使_________________，达不到分离的效果。

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2．色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在________中膨胀，加入洗脱液的湿凝胶

__________________以加速膨胀。

3．凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不能有________存在，它会搅乱洗脱液中蛋白质的________，

降低________。

4．蛋白质的分离：如果红色区带____________地移动，说明色谱柱制作成功。

【对应训练1】某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题：

（1）在装有洗涤好的红细胞的烧杯中加入＿＿＿＿＿＿＿＿＿后充分搅拌，使红细胞破裂，释放出血红蛋白。

（2）血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

（3）如右图所示，该小组采用＿＿＿＿＿＿法对蛋白质进行纯化。在蛋白质分离过程中，如果观察到＿＿＿＿＿＿＿＿＿说明色谱柱制作成功。

（4）图中a、b均为蛋白质分子，从色谱柱中b洗脱出来的速度较＿＿＿（填“快”或“慢”），原因＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。

（5）利用琼脂糖凝胶电泳技术将得到的蛋白质进行分离鉴定。在电泳过程中，影响蛋白质迁移速率的因素包括蛋白质分子的＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿以及分子的形状等。

【对应训练2】对蛋白质进行研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。回答下列问题：

(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：_____________、____________、____________和纯度鉴定。

(2)在血红蛋白的提取与分离实验中，采集新鲜血液前要在采血容器中加入柠檬酸钠溶液的目的是________ ________。

(3)样品的处理过程又可以细分为：红细胞的洗涤、________和分离血红蛋白溶液。其中分离血红蛋白溶

液时需要用到_______ _____(仪器)分出下层红色透明液体。

(4)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析进行粗分离。

①透析的目的是_______________________________________________________；

②透析的原理是______________________________________________________ (5)通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

①样品纯化的目的是________________________________________________；

②血红蛋白的特点是____________________________________________________；

这一特点对分离血红蛋白的意义是___________________________________________

【对应训练3】如图表示血红蛋白提取和分离实验的部分装置或操作方法，请回答：

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(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂质蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是___________________________________________。

(2)图甲表示_______________过程，该操作目的是去除样品中_________________的杂质。现有一定量的血红蛋白溶液，进行上述操作时若要尽快达到理想的实验效果，可以_________________________(写出一种方法)。一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色，并说明判断的依据：________________________________________________________________________。

(3)图乙是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入示意图，正确的加样顺序是________________。在进行④操作时要________(填“打开”或“关闭”)下端出口。

【对应训练4】比较水蒸气蒸馏法、压榨法和有机溶剂萃取法：

提取方法

实验原理

方法步骤

水蒸气蒸馏

→分离 →除水 浸泡、漂洗

→ →过滤

→静置

→再次 粉碎、干燥

→ →过滤

→浓缩

适用范围

适用于提取玫瑰油、薄荷油等 强的芳香油

利用 将挥发性较强水蒸气蒸馏

的芳香油携带出来

通过 加压，

压榨出果皮中的芳香油

压榨

适用于 等易焦糊原料的提取

有机溶

剂萃取

使芳香油溶解在 中，蒸发溶剂后就可获得芳香油

适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能 ，能充分浸泡在 中

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1.（1）蒸馏水和甲苯

（2）去除（血红蛋白溶液中的）分子较小的杂质

（3）凝胶色谱 红色区带均匀一致地移动

（5）大小

带电性质

答案：(1)样品处理

粗分离

纯化

(2)防止血液凝固

(3)血红蛋白的释放

分液漏斗

(4)①去除相对分子质量较小的杂质

②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则被留在袋内

(5)①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂蛋白除去

②呈现红色

在用凝胶色谱法分离血红蛋白时，可以通过观察颜色来判断什么时期该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作

21. (1)防止红细胞吸水破裂

(2)透析(粗分离) 分子量较小

增加缓冲液的量(或及时更换缓冲液) 出现紫色，因为双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血红蛋白反应，生成紫色物质

(3)②③④①

关闭

【对应训练】

（4）慢 b相对分子质量较小，容易进入凝胶内部的通道，移动路程较长

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